日前，使用名為“基因捕獲”（gene trap）的技術(shù)，奧地利的研究人員建立了一個(gè)人類(lèi)單倍體細(xì)胞庫(kù)，這個(gè)細(xì)胞庫(kù)匯集了3000 多種細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞系都具有一種不同的突變基因。相關(guān)的研究論文發(fā)表在8月25日的Nature Methods雜志上。渥太華大學(xué)教授William Stanford說(shuō)：“我認(rèn)為這是一個(gè)相當(dāng)有趣的資源，我想人們會(huì)支持它。它的作用看起來(lái)非常強(qiáng)大。”

利用這些單倍體細(xì)胞系可以極大地促進(jìn)基因功能研究。由于這些細(xì)胞中只含有一組染色體，其它染色體上等位基因突變的影響可以被屏蔽。斯坦福大學(xué)教授Jan Carette說(shuō)：“相比于其他的技術(shù)，完全的基因敲除（complete knockout）可以獲得更強(qiáng)大的表型。”人體細(xì)胞是二倍體，單倍體細(xì)胞系無(wú)法直接獲得，因此奧地利科學(xué)院分子醫(yī)學(xué)（CEMM）研究中心的Sebastian Nijman和他的同事轉(zhuǎn)而對(duì)KBM7人體細(xì)胞系進(jìn)行研究。

KBM7 來(lái)源于一名慢性粒細(xì)胞白血病患者，除8號(hào)染色體外其余染色體全部都單倍化。雖然這些細(xì)胞是單倍體，它們?nèi)匀荒軌驁?zhí)行基本功能維持活力。“有些人認(rèn)為，單倍體細(xì)胞是一些反常的細(xì)胞，但實(shí)際上，在細(xì)胞水平，單倍體與生命非常相容，”斯坦福大學(xué)教授Jan Carette表示。要構(gòu)建每一種突變，研究人員用偏好于整合到活性轉(zhuǎn)錄的基因中的反轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)感染細(xì)胞。Nijman認(rèn)為“*終的結(jié)果是該基因幾乎完全被沉默，類(lèi)似于進(jìn)行了基因敲除” 。

每個(gè)突變株都包含一個(gè) GFP 標(biāo)記和一個(gè)獨(dú)特的遺傳條形碼，這樣可以便于該突變株從克隆混合物中被識(shí)別。這些克隆另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們的突變是可逆的。“基因捕獲”載體的兩側(cè)是 loxP 序列。為這些細(xì)胞提供Cre重組酶，對(duì)loxP 進(jìn)行切除，研究人員就可以去除被捕獲的基因，并恢復(fù)正常的蛋白質(zhì)翻譯。

為了驗(yàn)證他們的細(xì)胞庫(kù)，Nijman和他的同事們對(duì)他們創(chuàng)造的幾個(gè)克隆的特征進(jìn)行了特征鑒定。例如，位于JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個(gè)JAK2 基因捕獲的克隆，通常顯示 STAT1 磷酸化水平降低。“雖然在意料之中，這是次利用完全失活的 JAK2 基因在人類(lèi)細(xì)胞中證實(shí)這一點(diǎn)，” Nijman表示。

研究人員表示，從理論上講，這樣一個(gè)完整的覆蓋了所有包括編碼或非編碼基因的細(xì)胞庫(kù)，為系統(tǒng)地研究幾乎所有細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞周期控制、代謝、耐藥或藥物敏感等所需的基因功能及作用提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。到目前為止，該研究小組已經(jīng)累計(jì)構(gòu)建出了幾千個(gè)人類(lèi)基因組突變體，這些突變體可以通過(guò)Haplogen 和 CeMM 合作得到。

分子健康科學(xué)研究所的Anton Wutz認(rèn)為臨床研究人員將會(huì)尤其對(duì)這些克隆感興趣。細(xì)胞生物學(xué)家可以產(chǎn)生自己的突變細(xì)胞株，而臨床實(shí)驗(yàn)條件缺乏、想要檢測(cè)患者突變的臨床醫(yī)生可以通過(guò)索取得到這些克隆進(jìn)行檢測(cè)，以確定他們所看到的是真正的病因還是與疾病不相關(guān)的現(xiàn)象。

這些克隆也存在一些局限。特別是KBM7 細(xì)胞并不能表達(dá)所有的基因。將這種方法擴(kuò)展到來(lái)源于不同器官的單倍體細(xì)胞，尤其是單倍體胚胎干細(xì)胞，將大大增加實(shí)用性。Nijman補(bǔ)充說(shuō)他們的研究小組還在繼續(xù)擴(kuò)大這一細(xì)胞庫(kù)，但由于所整合的載體是隨機(jī)的，產(chǎn)生新的細(xì)胞突變將越來(lái)越困難。如果結(jié)合其他方法，例如轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（transcription activator-like effectors ，TALE）和RNA 引導(dǎo)性核酸酶（ RNA-guided nucleases，RGNs），基因捕獲技術(shù)或許可以幫助研究人員擴(kuò)展細(xì)胞庫(kù)。

Nijman的細(xì)胞庫(kù)匯集了越來(lái)越多的技術(shù)，研究人員可以用它來(lái)更深入地了解人類(lèi)基因組。制造人類(lèi)基因組突變池，絕對(duì)是一件有前途的事情。

基因捕獲技術(shù)簡(jiǎn)介

基因捕獲技術(shù)是目前*具應(yīng)用前景的基因克隆方法。利用該技術(shù)建立的隨機(jī)插入突變的突變體文庫(kù)，可用于尋找、鑒定和研究大量未知功能和已知功能的活化基因，它是繼自然突變、物理突變和化學(xué)突變之后發(fā)展起來(lái)的新的分子生物學(xué)方法。

基因捕獲的方法酷似以報(bào)告基因?yàn)檎T餌來(lái)捕獲基因。其基本過(guò)程是將一含報(bào)告基因的DNA 載體隨機(jī)插入基因組,從而產(chǎn)生內(nèi)源基因失活突變,并通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)激活提示插入突變的存在,及突變內(nèi)源基因表達(dá)特點(diǎn)。通過(guò)篩選得到的插入突變的ES 細(xì)胞克隆經(jīng)囊胚注射轉(zhuǎn)化為基因突變動(dòng)物模型,進(jìn)而分析表型來(lái)研究突變基因功能。每一種ES 細(xì)胞克隆中含有不同的突變基因,在短期內(nèi)可建立大量含不同基因突變的ES 細(xì)胞克隆庫(kù)。突變基因的序列可通過(guò)基于PCR 的一些方法鑒定,同時(shí)還可能發(fā)現(xiàn)一些在體內(nèi)表達(dá)或不表達(dá)的新基因。

基因捕獲技術(shù)主要包括三種類(lèi)型：

1.增強(qiáng)子捕獲載體

含有一個(gè)*小的啟動(dòng)子和翻譯起始位點(diǎn),當(dāng)載體整合到順式增強(qiáng)子元件附近時(shí),此增強(qiáng)子將調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá) 。對(duì)報(bào)告基因在體內(nèi)表達(dá)的ES 細(xì)胞系插入位點(diǎn)進(jìn)行克隆鑒定發(fā)現(xiàn)插入位置鄰近編碼序列。關(guān)于增強(qiáng)子捕獲的誘變比率還未見(jiàn)報(bào)道,但插入的性質(zhì)預(yù)示由增強(qiáng)子捕獲產(chǎn)生功能失活的突變比率較低,因此,增強(qiáng)子捕獲載體在小鼠體系中未得到廣泛應(yīng)用。

2.啟動(dòng)子捕獲載體

通常由不含啟動(dòng)子成分的報(bào)告基因和一篩選標(biāo)記基因組成,只有當(dāng)載體插入到內(nèi)源基因編碼區(qū)序列中產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄本時(shí)報(bào)告基因才可能表達(dá) 。因而啟動(dòng)子捕獲的致突變比率很高。然而載體插入到外顯子的頻率非常低,捕獲效率較增強(qiáng)子捕獲至少低200倍。故載體中通常含有一個(gè)篩選標(biāo)記基因,如新霉素抗性基因（ neo） 或β-半乳糖苷酶（galactosidase） 與neo 的融合基因（β-GEO） ,保證載體插入的細(xì)胞克隆被篩選保留。由于插入發(fā)生在DNA 轉(zhuǎn)錄區(qū),克隆插入位點(diǎn)就可確定突變基因。

3.基因捕獲載體

中在無(wú)啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因上游和下游分別含有剪接受體（ splice acceptor ,SA） 和多聚腺苷酸加尾序列（polyA） ,當(dāng)含有順式作用的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件被捕獲基因轉(zhuǎn)錄激活時(shí),載體中SA 與內(nèi)源基因剪接供體（ splice donor ,SD） 作用產(chǎn)生上游內(nèi)源基因編碼序列與報(bào)告基因融合轉(zhuǎn)錄本,使內(nèi)源基因發(fā)生突變,同時(shí)報(bào)告基因的表達(dá)提示內(nèi)源基因的表達(dá)特點(diǎn)。融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可作為克隆突變基因序列的模板。由于插入發(fā)生在內(nèi)含子中,基因捕獲的效率較啟動(dòng)子捕獲至少提高50 倍。然而選擇性剪接（alternative splicing） 的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致低水平的野生型轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生而形成減效等位基因突變 （轉(zhuǎn)自 生物探索）

原創(chuàng)作者：上海信帆生物科技有限公司