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實(shí)驗(yàn)室代測實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

(elisa試劑盒）阿維菌素類藥物多殘留分析方法的研究

點(diǎn)擊次數(shù)：17389 發(fā)布時(shí)間：2013/9/12 10:29:57

阿維菌素類藥物（Avermectins, AVMs）屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,由于其優(yōu)良的驅(qū)蟲活性而廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。然而作為高毒化合物,AVMs在動(dòng)物組織中的殘留不容忽視。本研究旨在制備針對(duì)AVMs的抗體,以此為核心試劑建立檢測動(dòng)物組織中AVMs殘留的ELISA快速篩選方法和免疫親和色譜-高效液相-熒光檢測（IAC-HPLC-FLD）技術(shù)。將阿維菌素（Avermectin, AVM）、伊維菌素（Ivermectin, IVM）和多拉菌素（Doramectin, DOR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,制備半抗原4"-o-succinoylAVM、4"-o-succinoyl IVM和4"-o-succinoyl DOR。質(zhì)譜鑒定其分子量為995.7（M+Na~+）、997.8（M+Na~+）和998.6（M-H~+）,與目標(biāo)產(chǎn)物分子量一致。將半抗原與載體蛋白BSA偶聯(lián),制備免疫抗原,免疫動(dòng)物制備抗體。半抗原與OVA偶聯(lián),制備包被抗原。免疫抗原與包被抗原紫外掃描光譜鑒定,載體蛋白與半抗原的結(jié)合比1:3.4-1:31.6。篩選出的抗AVM的多克隆抗體對(duì)AVMs有較高的交叉反應(yīng):埃普里諾菌素（Eprinomectin, EP）為145.4%、AVM為100%、IVM為25.0%、DOR為12.3%。以此抗體為基礎(chǔ)建立ELISA檢測方法,可同時(shí)檢測牛組織中的AVM、IVM和EP殘留。確定包被抗原的包被濃度為1:5000,抗體的工作濃度為1:5000,酶標(biāo)二抗的工作濃度為1:2000。標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=-45.613x+81.191,R~2=0.9951,IC_（50）=4.8ng/mL,線性范圍為1.1-21.9ng/mL�？瞻着８闻K組織中以20、50和100ng/g濃度添加時(shí),AVMs回收率為53.8-80.4%,變異系數(shù)為3.4-17.9%;空白牛肌肉組織中以5、10和20ng/g濃度添加時(shí),AVMs回收率為70.9-108.6%,變異系數(shù)為3.7-17.1%。國內(nèi)外率先研制出可同時(shí)檢測牛肝臟和牛肌肉組織中的AVM、IVM和EP殘留的elisa試劑盒。本研究對(duì)試劑盒的各溶液配方進(jìn)行選擇,并確定試劑盒的技術(shù)參數(shù):試劑盒的靈敏度（IC_（50））為3.0-7.0ng/mL,空白牛肝臟組織檢測限為8.4-9.6ng/g,空白牛肌肉組織檢測限為0.5-0.8ng/g。該試劑盒中抗體對(duì)AVM、IVM、EP和DOR的交叉反應(yīng)率分別為100%、25.0%、145.4%和12.3%。試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)符合要求,試劑盒的保存實(shí)驗(yàn)證明,該試劑盒可在2-8℃保存6個(gè)月。國內(nèi)外率先制備了可同時(shí)檢測AVM、IVM、DOR和EP殘留的高容量的IAC柱,AVM、IVM、DOR和EP的動(dòng)態(tài)柱容量分別為3531、3542、3543和3284ng/mL gel,絕對(duì)柱容量分別為495、499、493和460ng/mg IgG。IAC柱在一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)重復(fù)使用15次后,AVMs的動(dòng)態(tài)柱容量仍能達(dá)到1300ng/mL gel。建立了IAC-HPLC-FLD檢測方法,可同時(shí)檢測動(dòng)物組織中的AVM、IVM、EP和DOR殘留。以5、10、50和100ng/g的濃度水平添加時(shí),空白牛肝臟組織4種藥物添加回收率為79.4-113.8%,變異系數(shù)為1.1-19.4%;牛肌肉組織中4種添加藥物回收率為77.3-119.5%,變異系數(shù)為1.5-18.9%。方法的檢測限為0.8ng╱g。

原創(chuàng)作者：上海信帆生物科技有限公司