成功的實(shí)驗(yàn)都是相似的，不成功的實(shí)驗(yàn)則各有各的不幸。說起Western blotting，原理雖然簡單，但個(gè)中甜酸苦辣，只有自己才知道。對于成功的Western blotting而言，關(guān)鍵因素有很多：一抗、二抗、轉(zhuǎn)印、顯色。膜，卻往往被忽略，常常是，別人用什么，我也用什么；實(shí)驗(yàn)室有什么，我就用什么。但每個(gè)人的研究對象不同，適合別人的未必適合你。
在選擇膜時(shí)，我們要考慮兩個(gè)關(guān)鍵因素：膜的類型和孔徑大小。在你決定了這兩個(gè)因素后，你還可以選擇膜的形式等。Bio-Rad公司實(shí)驗(yàn)室分離部門的全球產(chǎn)品經(jīng)理Thomas Davies是這方面的專家，他提出了一些建議。
PVDF vs. NC
讓我們先來看看Western blotting中*常用的兩種膜：PVDF膜和硝酸纖維素（NC）膜。每一種膜的性質(zhì)不同，也適合不同的實(shí)驗(yàn)條件。讓我們先來看看每一種膜的物理性質(zhì)和性能特點(diǎn)吧。
PVDF膜之所以如此受人歡迎，是因?yàn)樗哂袔讉�(gè)關(guān)鍵特性。首先，它帶來了高的機(jī)械強(qiáng)度和耐化學(xué)腐蝕性，因此適合反復(fù)使用（reprobing）。同時(shí)，PVDF膜也比NC膜具有更高的結(jié)合能力，150-160 µg/cm2 vs. 80 µg/cm2，這意味著它提供了更高的靈敏度。
由于PVDF的疏水性，這些膜也成為疏水蛋白質(zhì)（如膜蛋白）的。也正因?yàn)槿绱�，這種膜需要一個(gè)簡短的甲醇“潤濕”步驟。如果你在熒光blot中選擇PVDF，那么須選擇一種低熒光的PVDF膜，它與標(biāo)準(zhǔn)PVDF膜的特性相同，但自發(fā)熒光極低。
硝酸纖維素膜一度是Western blotting中的，現(xiàn)在也頗受歡迎，因?yàn)榈鞍着c硝酸纖維素的結(jié)合是瞬時(shí)的，幾乎不可逆轉(zhuǎn)，而膜很容易水化。
傳統(tǒng)的硝酸纖維素膜不適合反復(fù)使用，也不耐受劇烈的化學(xué)處理。對于這些情況，支持的硝酸纖維素膜是個(gè)更好的選擇。它包含了惰性的支持結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)膜的強(qiáng)度和韌性。
孔徑大小
選擇膜時(shí)的第二個(gè)考慮是孔徑大小。Western blotting的膜是微孔基質(zhì)，可與蛋白結(jié)合；孔的大小決定了哪些蛋白會(huì)成功結(jié)合，而哪些蛋白會(huì)穿過。
Western blotting的膜通常有兩個(gè)孔徑大小。對于大部分實(shí)驗(yàn)，0.45 µm的膜是不錯(cuò)的選擇，它適合分子量高于20 kD的蛋白；而0.2 µm的膜更適合小于15 kD的低分子量蛋白。記住一個(gè)原則：如果檢測上樣量低的蛋白，或是定量檢測，那么寧小勿大。
形式
目前市場上有多種包裝形式的膜，讓人眼花繚亂。在選擇這些膜時(shí)，你必須考慮到轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（半干、濕轉(zhuǎn)）、方便性以及價(jià)格等。
• 一大卷，這是*受歡迎的形式，因?yàn)槟さ拿娣e很大（如26 cm x 3.3 m），經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。你可以根據(jù)凝膠的大小來切割，相當(dāng)靈活。當(dāng)然，這需要花費(fèi)一些時(shí)間，也會(huì)帶來膜大小的差異。
• 預(yù)切膜，由制造商預(yù)先切好，省時(shí)省力，就是不省錢。很多公司提供各種大小的預(yù)切膜。生物通
• 預(yù)切且預(yù)潤濕的膜。如果高通量、方便性對你很重要，那么這種就是*佳之選。
Western blotting的確有很多不確定的因素，因?yàn)楹茈y控制每個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)�？刂坪梦覀兯芸刂频�，那就離成功又近了一步。
原創(chuàng)作者：上海信帆生物科技有限公司
總訪問量：4978665 管理登錄
