1、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)幔ㄒ岳�于溶解雙丙稀酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和1%（w/v）N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。）儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。
2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%（w/v）0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。
3、 分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL（pH8.8）:18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后4°C保存。
4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL（pH6.8）:6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后4°C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應(yīng)受到抑制。AP提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.
6. 10%過硫酸銨溶液： 稱取1g過硫酸銨，加超純水溶解并定容至10ml，分裝到1.5ml微量離心管中，凍存。
7、 SDS-PAGE加樣緩沖液:在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。
8、 Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，臨用前稀釋10倍。PH8.3
9、 轉(zhuǎn)移緩沖液： 2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（臨用前加），加水至總量1L。
10、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。
11、 脫脂奶粉5%（w/v）。
12、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有毒，戴手套操作），溶于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。
4.2.4  22. 聚丙烯酰胺凝膠溶液：
分離膠12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml
超純水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml
30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 ml
pH8.8、1.5mol/LTris溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml
10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml
TEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml
10%過硫酸銨 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml

濃縮膠：5% ，pH6.8   2 ml  4 ml  6 ml
超純水  1.4 ml  2.8 ml  4.1 ml
30%丙烯酰胺溶液  0.3 ml  0.6 ml  1.0 ml
pH6.8、1.0mol/LTris溶液  0.25 ml  0.5 ml  0.75 ml
10%SDS  0.02 ml  0.04 ml  0.06 ml
TEMED  0.002 ml  0.004 ml  0.006 ml
10%過硫酸銨  0.02ml  0.04ml  0.06ml

一．配膠
1．  注意一定要將玻璃板洗凈，*后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。
2．  分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可
3．  封膠：灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。
4．灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正；若變形嚴(yán)重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^的膠凝時其內(nèi)部分子的排列尚未完成。

二．樣品處理
1．培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）：
⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。
⑵ 對于6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
⑶ 100℃，1min。
⑷ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。
⑸ 用干凈的針尖挑絲，如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉，如果沒有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團(tuán)塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復(fù)抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。
⑹ 待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。
2．培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）：
⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。
⑵ 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g離心，4℃，2min。
⑸ 取少量上清進(jìn)行定量。
⑹ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。
3．組織：
⑴ 勻漿 對于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液�？墒謩踊螂妱觿驖{。注意盡量保持低溫，快速勻漿。
⑵ 12000g離心，4℃，2min。
⑶ 取少量上清進(jìn)行定量。
⑷ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。



三．電泳
1．上樣前將膠板下的氣泡趕走。
2．所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1×loading buffer上樣，Marker也用1×loading buffer調(diào)整至與樣品等體積。
2．以初始電壓為45V時的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)電壓達(dá)65V時改為穩(wěn)壓電泳。
3．在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結(jié)束。

四．轉(zhuǎn)膜
1．電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開始準(zhǔn)備：
濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去離子水至1,000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細(xì)作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。
2．取膠：
將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)一張（干轉(zhuǎn)每側(cè)三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路）
3．轉(zhuǎn)膜：
濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時。負(fù)載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。

五．封閉及雜交
1．封閉：
將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。
2．結(jié)合一抗：
一抗的準(zhǔn)備：使用反貼法時每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。
反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。
3．洗滌：
一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．結(jié)合二抗：
根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體，按相應(yīng)比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時。
5．洗滌：
二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

六．發(fā)光鑒定
一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。
1．HRP-ECL發(fā)光法：
將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。
2．AP-NBT/BICP顯色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個 EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。

七．增強(qiáng)敏感性
若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度：
1．  用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重加發(fā)光液進(jìn)行曝光，可延長曝光時間。
2．  將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長，期間至少換2次液。
3．  封閉40~60min
4．  一抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。
5．  PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。
6．  二抗雜交，37℃ 1h。
7．  PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。
8．  發(fā)光鑒定。
9．  若條帶仍未出現(xiàn)或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。
10．三抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。
12．發(fā)光鑒定。

八．NC膜的多次使用
一張NC膜可使用多次，對多種蛋白進(jìn)行雜交，步驟與“七．增強(qiáng)敏感性”相近。
1．  如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置差別較大則只需用PBST洗滌掉發(fā)光液（10min×3次）后從一抗雜交開始，后續(xù)步驟同前。
2．  如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置較近則需更強(qiáng)的洗滌，可用 strip液（可用雜交袋）于室溫?fù)u動洗滌30min~60min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。
3．  對于雜交若干次的膜，如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強(qiáng)度更強(qiáng)的自配的strip液（可用雜交袋）于50℃洗滌30min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。

Western的原理
幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。*常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關(guān)。在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結(jié)合1.4克去污劑，借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物，則可測算出多肽鏈的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液，當(dāng)兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推進(jìn)。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。
樣品和積層膠中含Tris-Cl（pH6.8），上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸（pH8.3），分離膠中含Tris-Cl（pH8.8）的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS（Laemmli,1970），樣品和積層膠中的氯離干形成移動界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚，此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS多肽復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。
電泳 丙烯酰胺凝膠電泳通常用來查看蛋白混合物樣品的復(fù)雜程度和監(jiān)測純化效果。這種方法分離效果極好，可惜很難在不喪失精度情況下放大到制備規(guī)模，因?yàn)殡S著膠厚度的增加，電泳時的熱效應(yīng)會嚴(yán)重干擾蛋白的泳動。
Western bloting首先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。毛細(xì)管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質(zhì)并用重物壓好，緩沖液就會通過毛細(xì)作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質(zhì)帶到NC膜上，NC膜可以與蛋白質(zhì)通過疏水作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。但是這種方法轉(zhuǎn)移效率低，通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中的一小部分蛋白質(zhì)（10%-20%）。而電泳印跡可以更快速有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)移。這種方法是用有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和NC膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)在電場力的作用下離開凝膠結(jié)合到NC膜上。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機(jī)械裝置不同。濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。半干轉(zhuǎn)移，用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法要快（15-45 分鐘）。
轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測。印跡首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，而其它的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。處理過的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。目前有結(jié)合各種標(biāo)記物的抗體特定IgG的抗體（二抗）可以直接購買，*常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚�，�?dāng)酶催化底物生成有顏色的產(chǎn)物時，就會產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以將H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?-氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾并發(fā)光，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測出辣根過氧化物酶的存在，即目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在了。除了使用抗體或蛋白作為檢測特定蛋白的探針以外，有時也使用其它探針如放射性標(biāo)記的DNA，可以檢測印跡中的DNA結(jié)合蛋白。
在Western bloting實(shí)驗(yàn)中，有另一種方法，就是直接標(biāo)記一抗，再用底物顯色。這種方法叫直接法，與用二抗的間接法相比有諸多不足，標(biāo)記二抗可用于很多種不同特異性的一抗，避免了標(biāo)記很多一抗的需要，同時因?yàn)橐豢菇Y(jié)合不止一個二抗分子，所以二抗可以增強(qiáng)信號。所以一般情況下都釆用間接法進(jìn)行檢測。
Western bloting要注意的一些問題
1、為了讓實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)有說服力都要設(shè)計(jì)對照實(shí)驗(yàn)，對照分為：陽性對照（有標(biāo)準(zhǔn)品（比如β-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關(guān)對照（用無關(guān)抗體）
2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇*適當(dāng)?shù)谋壤�，一抗二抗的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及背景
3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來個體差異。特別在做裂解液時更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實(shí)驗(yàn)帶來不確定性。
4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要特別注意幾點(diǎn)：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導(dǎo)致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點(diǎn)樣孔平整。
5、電泳、轉(zhuǎn)膜時特別要注意正負(fù)極，電壓電流都不能過高；轉(zhuǎn)膜時“三明治”的疊放次序不錯，同時要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉(zhuǎn)溫度保持在10度以下，冰浴為宜。
6、封閉時一般在室溫下2h就夠了，但是要注意如果是生物素標(biāo)記的二抗就不宜用牛奶，因?yàn)榕Ｄ讨泻�有生物素，用BSA效果更好。
7、加一抗二抗要嚴(yán)格保證反應(yīng)時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；

容易忽視的問題主要在于過硫酸銨（AP）一定要新鮮——用小指管配AP（寫日期）保存在-20度，超過2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復(fù)打開使用多次的AP都別用
上樣電泳：上樣前蛋白樣品離心，上樣量不宜過多，以免看結(jié)果時，每個條帶都彎彎地“笑”你貪多嚼不爛哦。其他的操作，按照說明控制電流，不要過多重復(fù)使用電泳Buffer（別小氣，重復(fù)使用會降低緩沖能力的）。當(dāng)預(yù)染的Marker告訴你，你要分辨的蛋白已經(jīng)到達(dá)*佳分辨區(qū)——分離膠的2/3處，OK，電泳結(jié)束了。
電泳結(jié)果檢查：如果要做Western Blot，是否需要先檢查電泳結(jié)果呢？能先看看結(jié)果如何再進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)膜當(dāng)然�？捡R斯亮藍(lán)使用簡便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是*經(jīng)濟(jì)通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法�？墒怯捎诳捡R斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過固定不可逆結(jié)合，會干擾后面的Western Blot實(shí)驗(yàn)，很多人會選擇省略掉這一步——同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以說明問題。所以*經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法是：麗春紅S，直接染色轉(zhuǎn)移膜，檢測轉(zhuǎn)膜效果，充分脫色后不干擾Western結(jié)果。麗春紅的檢測靈敏度和考馬斯亮藍(lán)差不多。
轉(zhuǎn)膜：經(jīng)過PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過“轉(zhuǎn)膜”步驟——從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，才能用各種方法進(jìn)行Western Blot的檢測和顯色，而且為了防止沒有電場的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴(kuò)散，轉(zhuǎn)移要盡快進(jìn)行轉(zhuǎn)膜的首要是選膜。
Western Blot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。選擇的根據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大�。�；b.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。
  NC膜   尼龍膜   PVDF膜
靈敏度和分辨率   高   高   高
背景   低   較高   低
結(jié)合能力   80－110 ug/cm2   >400 ug/cm2   125－200 ug/cm2（適合于SDS存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合）
材料質(zhì)地   干的NC膜易脆   軟而結(jié)實(shí)   機(jī)械強(qiáng)度高
溶劑耐受性   無   無   有
操作程序   緩沖液潤濕,避免氣泡    緩沖液潤濕   使用前100%甲醇潤濕
檢測方式   常規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢測   不能用陰離子染料   常規(guī)染色， 比較于NC膜，可用考馬斯亮藍(lán)染色，可用于ECL檢測，快速免疫檢測。
適用范圍   0.45um 一般蛋白
0.2um一分子量小于20kD蛋白
0.1um一分子量小于7kD蛋白  低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸檢測中）   糖蛋白檢測和蛋白質(zhì)測序
價格   價格較便宜   便宜   較貴
1. 硝酸纖維素膜
硝酸纖維素膜是蛋白印跡*廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光（Luminol類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很簡便，比如不需要甲醛預(yù)處理，只要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比如NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間，不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途——因?yàn)榻?jīng)不起多次“折磨”。選擇硝纖膜時要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小于7KD的話選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜——混有含醋酸纖維（CM）的NC膜結(jié)合力會有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上結(jié)合的蛋白會因?yàn)橐恍┤ノ蹌┒�被代替，因此在封閉時使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%（據(jù)說0.05%效果）。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素——這在前面已經(jīng)提到，會影響蛋白質(zhì)結(jié)合。Protran由于是純NC膜，比較脆，機(jī)械耐受力欠佳，需要小心操作，如果擔(dān)心自己“粗手粗腳”，那么就可以考慮一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著稱的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。卷膜肯定是*實(shí)惠的選擇，只不過要自己動手裁剪——切記，必須帶手套操作。
2. PVDF膜
與硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更優(yōu)越的性能。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200μg/cm2（而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比硝纖膜強(qiáng)6倍�。�。但是PVDF膜的優(yōu)點(diǎn)不僅于此：更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測中成為理想選擇；而且單個凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的，特別是需要做N端蛋白測序，在相當(dāng)“嚴(yán)酷”的清洗條件下，當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白測序的選擇。但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預(yù)處理（不超過15秒）再用緩沖液平衡，才能用，而且適用過程中萬一干了也要同樣程序再處理（不過要真出現(xiàn)這種問題也是自己欠扁，誰要你不小心呢，轉(zhuǎn)膜前處理也就罷了，轉(zhuǎn)膜后再這樣處理可能會影響后繼的抗體識別呢）。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的，后者孔徑小，對小分子蛋白有較好的攔截吸附，背景可能會比前者稍高。
卷膜經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，裁剪剩下的邊角料還可以用來做點(diǎn)雜交。再次強(qiáng)調(diào)的是，疏水PVDF膜在用前必須經(jīng)過50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘，待膜變成半透明后用純水漂洗一下，轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）
A：實(shí)際操作
1.  做膠前的準(zhǔn)備
1）檢查是否有足夠的、干凈的 spacer、comb 和架子。
2）檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。
3）按將要檢測的抗體對應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計(jì)算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。
2.  制膠，電泳
1）裝好架子。
2）配分離膠，在膠上面加入一層蒸餾水，促進(jìn)膠更好的凝集。
3）待分離膠凝集后，配制濃縮膠倒好后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。
4）上樣，電泳。 上層膠用60-80V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時，用100-120V電壓。電泳時間在1.5小時左右。
B ：注意事項(xiàng)及常遇到的問題
1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。
2）上樣蛋白量不應(yīng)超過30ug/mm2 （載荷面積：如果你的膠槽是5mm×1mm，則載荷面為：1mm×5mm=5mm2） 。
3）gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集，過快表示TEMED、APS用量過多，此時膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實(shí)際不純或失效。
4）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。
5）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：
︶ 條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。
︵ 條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。
拖尾：樣品溶解不好。
紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。
條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。
條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過多。
三、轉(zhuǎn)移
在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。
膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ（0.2um for MW<20kDa）。
A 半干法
即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因?yàn)殡娏髦苯幼饔迷谀つz上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。
1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇
電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時間
目的蛋白分子大�。╧Da）  膠濃度  轉(zhuǎn)移時間
80－－-140  8%  1.5-2.0
25－－-80  10  1.5
15－－40  12  0.75
<20  15  0.5
2 實(shí)驗(yàn)操作
（1）濾紙和膜的準(zhǔn)備 （在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開始準(zhǔn)備工作）。
A.  將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入transfer buffer中。
B.  將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。
（2）轉(zhuǎn)移
A.  將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的濕潤。
B.  將膠剝出，去掉stack gel，小心的移到膜上。
C.  剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。
D.  將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。
E.  轉(zhuǎn)移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時調(diào)整。

3 注意事項(xiàng)及常遇到的問題
1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。
2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。
3）因?yàn)槟さ氖杷�性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤
4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。
5）轉(zhuǎn)移時間一般為1.5 小時，（ 1mA-2mA/cm2，10% gel），可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時間和電流大小。
B 轉(zhuǎn)移后效果的鑒定
1．染膠
用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉(zhuǎn)移的效果。
2．染膜
有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于進(jìn)一步的分析。
四、封閉（block）
封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合，我們一般用non-fat milk。
在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好5%的Milk（TBST溶解）。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將膜放入milk中block（一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜），并清洗整理好用過的濾紙，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小時。
五、孵育一抗
A.  先將需要檢測的抗體準(zhǔn)備好，并決定好它們的稀釋度。
B.  配好5%的Milk（TBST溶解），按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀釋，采用梯度稀釋。
C.  將稀釋好的抗體和膜一起孵育。 一般采用RT 1小時，可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當(dāng)延長或縮短時間。
注意：為了便于后面分析結(jié)果，我們一般會選用已確定分子量大小而且純度高的抗體作為marker與一抗同時孵育。
六、洗滌
用 TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。然后5mins *5。
洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺。
七、孵育二抗
孵育 RT1 小時。 一般采用HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例為1:5000。
二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。
注意二抗的選擇有多種，要根據(jù)一抗來選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗
八、洗滌
用 TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。 然后5mins *5。
洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。
九、顯色（HRP酶）
1．增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）
Ecl 顯色原理：魯米諾在免疫測定中既可用作標(biāo)記物，也可用作過氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來。
　　試驗(yàn)步驟：
1）將兩種顯色底物1：1等體積混合（一般各1ml/membrane）。
2）將混合物覆蓋在膜表面，1-2分鐘，搖晃使均勻。
3）用保鮮膜把膜包起來，放入夾板中。
4）在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光1min。
5）顯影、定影。
6）根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時間和曝光區(qū)域，得到*佳結(jié)果。
注意：熒光在一段時間后會越來越弱。
記得全程手套操作，一則避免手印污染影響結(jié)果，二則保護(hù)自己（未交聯(lián)的丙烯酰胺、甲醛等等雖不立即致命但都會慢慢毒害你的身體）
1.   如果WB前沒有可參考的資料——比如不知道是否有表達(dá)，比如抗體少還要摸條件（稀釋度），可以用剪膜剩下的邊角料來先做幾組點(diǎn)雜交摸條件，省點(diǎn)時間省點(diǎn)試劑；
2.  去掉積層膠后，預(yù)染的Marker可用以識別膠上下方向和膜的正反面（預(yù)染Marker如果照著說明書用量，有可能在電泳時看不到條帶，但轉(zhuǎn)膜時有濃縮效應(yīng)而且背景白就可以看到了。如果要電泳能看到就要參考電泳的那個用量，或者多加1—2倍的量）；如果目標(biāo)蛋白小，指示劑也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示劑已經(jīng)跑出去了，就要留意分清膠上下方向，切個小角是常用的方法。膜和濾紙一起裁（不過濾紙上下疊多了膜不好剪，硝纖膜容易裂，用利刀+尺子+墊厚報(bào)紙劃比較容易）盡量和膠一樣大小，膠用純水沖洗一下后用電泳緩沖液平衡過再量。我自己通常剪的時候會故意長寬各比膠少1mm，保證膜和膠不會碰到對方背后的濾紙就好。
3.  對于特別小的蛋白，tricine SDS-PAGE電泳有助于提高蛋白大小在1KD—20KD間的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的濃度也不用太高（可參考2004年中國生物工程雜志上有一篇文章（有效分離1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方法）
4.  轉(zhuǎn)膜前膠要在轉(zhuǎn)移緩沖液里平衡一下防止膠變形，也有助于進(jìn)一步去掉可能有礙轉(zhuǎn)膜的雜質(zhì)。還有人在這一步浸泡幫助蛋白復(fù)性，可以直接在膠上檢測蛋白活性。
5.  膜漂在水面（或者甲醇液面）讓液體從下通過膜上的孔滲上來以趕走膜內(nèi)空氣，膜徹底浸潤后顏色會變深一點(diǎn)，任何白點(diǎn)或者斑都是沒有完全浸潤的標(biāo)志，會影響轉(zhuǎn)膜的。*后浸沒入緩沖液里平衡。甲醇處理PVDF不要超過15秒。以后的步驟中不要讓膜干涸了。
6.  電轉(zhuǎn)移緩沖液通常用Tris glycine系統(tǒng)，如果是轉(zhuǎn)膜后有部分樣品要蛋白測序，用CAPS緩沖液，減少甘氨酸對測序的污染。
7.  半干電轉(zhuǎn)移（Semi-Dry）用經(jīng)過緩沖液飽和的濾紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)轉(zhuǎn)移槽，非常節(jié)約試劑，而且效果也好。由于不用“泡”在緩沖液中，半干轉(zhuǎn)不單可用均一緩沖體系，也可以做非均一轉(zhuǎn)移緩沖體系。半干轉(zhuǎn)可以在30分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)膜（每平方厘米電流2.5—3.5mA，恒流，冷庫。如果電流要求小可以延長到60—90分鐘，但要防止過熱。如果有那種溫度貼，可以貼上參考溫度），即使205KD這么大的蛋白轉(zhuǎn)膜效率也高達(dá)80%。各種大小的蛋白的轉(zhuǎn)移效率都OK。半干轉(zhuǎn)可以上下層疊2塊膠+膜一起轉(zhuǎn)（面積還是按照單個計(jì)算），只要控制好單位面積的電流強(qiáng)度，防止過熱就好了�！�
8.  有人覺得轉(zhuǎn)膜加SDS有助于大分子蛋白轉(zhuǎn)膜，我個人持保留意見，因?yàn)镾DS等去垢劑影響硝纖膜和蛋白的結(jié)合，反而不好。
9.  如果只做Western Blot，膜可以用麗春紅S染色并在脫色前照相，對后面的免疫反應(yīng)影響不大。不要用考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑染色膜以免影響結(jié)果。如果有預(yù)染Marker需要用針或者筆扎眼記錄條帶位置，以免后面會洗掉而無法判斷結(jié)果。預(yù)染Marker也有助于判斷轉(zhuǎn)膜的效率和情況，如果比目標(biāo)分子大的Marker都已經(jīng)轉(zhuǎn)過去了，那就OK了。
10.  有人說在中性條件下電泳有助于蛋白測序，如果要蛋白測序需要提前一天倒膠，并說預(yù)電泳6小時（有還原劑如Glycolate）后再倒積層膠。除了要做HPLC分析應(yīng)該用麗春紅S而不要用考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑染色，其他的比如測序或者PTH都可以選靈敏度高些的考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑。
11.  轉(zhuǎn)印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白條帶，有時這種快速的方法可以不用染色識別條帶，避免染色膜影響后繼實(shí)驗(yàn)。
轉(zhuǎn)膜后的封閉注意：
12.  轉(zhuǎn)膜后，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限于封閉做的好不好。脫脂奶是*常用的經(jīng)濟(jì)配方，用這種封閉劑由于里面可能有痕量的生物素和堿性磷酸酶，可能造成背景污染而不適合生物素—親和素的檢測方法，脫脂奶也不適合堿性磷酸酶檢測（AP）方法。如果采用堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)，封閉劑用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸緩沖鹽加熱65度1小時確保堿性磷酸酶失活（可以加0.05%疊氮化鈉，新鮮）。經(jīng)濟(jì)的脫脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物選擇范圍也更寬，現(xiàn)在HRP是越來越普遍的選擇。但是疊氮鈉（NaN3）對辣根過氮化物酶（HRP）有滅活作用，如果用HRP檢測系統(tǒng)則封閉液不要加疊氮化鈉為好。切記：封閉時間和封閉劑的量都要足夠。
13.  如果選用AP作為顯色方法，封閉時就要選擇Tris緩沖體系，不要用PBS，因?yàn)镻BS干擾AP。

這些小孔的孔徑隨 “雙丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而變小，比率接近 1：20 時孔徑達(dá)到*小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”為1：29 配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相差只有3% 的蛋白質(zhì)。
分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）
膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS），封膠后切記，勿動。如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。
兩膠板之間的電泳液要滿. 接好正負(fù)極, 開始電泳, 可先小電壓,約50V ,大約跑過濃縮膠后再改為100V. 觀察MARKER的情況, 適時終止電泳.
建議說目的帶要跑到分離膠的2/3處比較好,但本人一直都在上1/3處,結(jié)果也還可以.如果濃縮膠跑的好的話, 幾個孔的蛋白會跑成一條直線.
注意加樣時間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液
未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時應(yīng)該戴手套防護(hù).梳子插入濃縮膠時,應(yīng)確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生,梳子拔出來時應(yīng)該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免針頭刺入膠內(nèi).
10* 電泳緩沖液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML.
不好溶,可用攪拌器.
可重復(fù)使用,每次加一些新的進(jìn)去.但本人每次都是配新的,也不麻煩.
轉(zhuǎn)膜：
跑完電泳后,取出膠,可以一塊做考馬思亮藍(lán)R250染色約30分鐘, 脫色液脫色, 看看蛋白條帶跑的如何,上樣量如何.
另一塊可用做轉(zhuǎn)膜. 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中搖30分鐘左右（有次著急只晃了10分鐘，結(jié)果也挺好的）。NC膜，0.22um ，效果挺好的，MARKER易染上，麗春紅也易著色，還一洗就掉。能比較清楚的了解轉(zhuǎn)膜效果。
不同轉(zhuǎn)膜儀和電源轉(zhuǎn)膜的條件不同，我用的是BIO-RAD 的半干轉(zhuǎn)（電壓不過25V的那款），電源是BIO-RAD的PC200，70KD的我轉(zhuǎn)50分鐘，20V，17KD的轉(zhuǎn)20V，30分鐘左右，條件不是很穩(wěn)定，有時半路打開蓋子看看MARKER轉(zhuǎn)的情況，但膜和膠的位置一定不能竄。也有人說用恒流，說1.2-2MA/CM2我看了一下，我的膠大約都是5*3左右大的，20V一般電流會是60-30MA之間，要是這樣算的話,就30MA, 我不太清楚.

跑膠 電泳Buffer重復(fù)利用的時候要注意，不能混濁，有時候能用個3－4次，有時候第二次都不行了，事先前預(yù)電泳一下，看看氣泡的均勻度；Buffer一定要淹過梳子孔，否則就會發(fā)現(xiàn)今天的蛋白不會跑；跑的時候先用低電壓跑過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，不要追求速度，慢慢跑條帶會分離的更好，特別是對于高分子量的目的蛋白；
1 本實(shí)驗(yàn)室采用的脫脂奶粉已經(jīng)存放了近兩年了，雖然是四攝氏度保存，但是其封閉質(zhì)量還是難以保證的。所以本人的試驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)了小斑點(diǎn)。建議使用BSA或?qū)Ｓ玫拿撝�奶粉進(jìn)行封閉，雖然貴點(diǎn)，但還是有個好點(diǎn)的結(jié)果比較好。
2 本人采用的是過夜封閉方法，雖然時間長，想想封閉效果應(yīng)該是沒有什么問題，但是一定要注意封閉液是否蓋過了全部的膜，不要漏掉任何一個小角落喲。
3 洗膜的時候，將膜放在平皿中，置于水平的試驗(yàn)桌面上，不時用手晃動一下平皿，這樣洗膜會比在脫色搖床上更完全。因?yàn)樵诿撋珦u床上晃動，有時洗滌液不足以完全沒過膜，在*后顯色的時候，會發(fā)現(xiàn)液體流過的一道道痕跡，使背景值增加。
4 其實(shí)在western blot中，以上操作都是小問題，*主要的是一抗的質(zhì)量和待檢測蛋白的提取質(zhì)量。在試驗(yàn)之前，先用陽性對照與一抗做免疫學(xué)沉淀檢測（如ELISA），看看其效價和質(zhì)量，以便確定在后來的雜交試驗(yàn)中一抗的選擇和加量。另外，在做雜交之前也先跑一塊PAGE膠，染色，檢測一下待檢蛋白的提取質(zhì)量。
5 在加一抗溫育之前，先將等量的一抗與野生型（即陰性對照）的蛋白在37攝氏度作用30分鐘，這樣可以封閉掉一抗的一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。
6 一定不要忘記做陰性對照和陽性對照，特別是陰性對照，不然結(jié)果出了什么問題，就無從分析了。
7 全程做下來，*后的顯色就像是個一錘定音的時刻，分外激動，但也應(yīng)該尤為專注，一旦目的條帶出現(xiàn)了，就要馬上對顯色進(jìn)行終止，要不然雜帶就要出來了。

“快速徹底裂解，先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強(qiáng)的裂解液，甚至直接給loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分變性，再分裝保存。有些時候比蛋白酶抑制劑更有效。
另一個感覺是樣品中目的蛋白的量，限于WB的檢測下限問題，一般目的蛋白量別低于1ng（雖然ECL法下限是0.1ng，即100pg），在10ng以上為好。這就要求在做WB之前必須充分考慮目的蛋白的可能豐度，充分的準(zhǔn)備工作然后設(shè)計(jì)細(xì)胞量或者組織量，千萬別把樣品搞稀了，否則就不好辦了。

Western Blot為什么必須要用內(nèi)參？
要檢測一個基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確，或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對變化，方法是Western Blot。因?yàn)閃estern Blot操作相對簡單方便，既可以定性分析表達(dá)產(chǎn)物，同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。雖然，順利的時候Western Blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結(jié)果啦、假陽性啦、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應(yīng)畢竟不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達(dá)產(chǎn)物，確實(shí)是有一定的不確定性的。所以，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中要求有良好的參照體系，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析是非常有用。特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應(yīng)的分子量大�。�，空白載體對照（如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對照），已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對照；另外還有內(nèi)參�？墒怯捎诮�(jīng)費(fèi)限制或者偷懶的原因，國內(nèi)的不少人做Western Blot往往省略參照，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)問題時無法分析結(jié)果――即便有結(jié)果也可能影響結(jié)果的分析。
內(nèi)參是*容易被忽略的一項(xiàng)。我們知道，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對多少，前提條件是等量的細(xì)胞上樣，才有比較的基礎(chǔ)。特別表達(dá)量不高時，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。所以你需要內(nèi)參。內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白（Housekeeping Proteins），它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
在Western Blotting中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時，分別檢測樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測內(nèi)參，觀測樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn)，至內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。
常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。*近的國外文獻(xiàn)報(bào)道中使用GAPDH內(nèi)參的較多。：GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，由4個30－40kDa的亞基組成，分子量146kDa。GAPDH基因幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，廣泛用作Western blot蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參。GAPDH檢測。Western Blotting（檢測條帶大約在36kDa，稀釋比例達(dá)10，000倍）、ELISA、親和純化、免疫熒光及免疫組化。注：因?yàn)镚APDH 作為管家基因在同種細(xì)胞或者組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般是恒定的。在實(shí)驗(yàn)中，可能存在總蛋白濃度測定不準(zhǔn)確；或者蛋白質(zhì)樣品在電泳前上樣時產(chǎn)生的樣品間的操作誤差；這些誤差需要通過測定每個樣品中實(shí)際轉(zhuǎn)到膜上的GAPDH的含量來進(jìn)行校正，所以一般的western實(shí)驗(yàn)都需要進(jìn)行內(nèi)參設(shè)置。具體校正的方法就是將每個樣品測得的目的蛋白含量與本樣品的GAPDH含量相除，得到每個樣品目的蛋白的相對含量。然后才進(jìn)行樣品與樣品之間的比較。反應(yīng)：抗GAPDH單抗（clone 6C5）能夠與魚、蛙、雞、兔、小鼠、大鼠及人組織來源的GAPDH反應(yīng)，但不能與酵母GAPDH反應(yīng)。一般我們選擇內(nèi)參與要檢測的目的蛋白的分子量相差5KD以上。

圖示: A-G分別表示不同實(shí)驗(yàn)小鼠心臟蛋白（上樣量50ug），兔抗小鼠Akt抗體（康成生物Cat＃KC-5A01）檢測心臟組織勻漿中Akt水平。加入兔二抗（康成生物Cat＃KC-RB-035，稀釋比例為1：5，000）時同時加入HRP標(biāo)記的抗GAPDH單抗（稀釋比例為1：10，000，康成生物Cat＃KC-5G5）。采用化學(xué)發(fā)光試劑盒（康成生物Cat＃KC-420）及X膠片曝光顯影。一次反應(yīng)即可同時檢測目的蛋白（Akt）與內(nèi)參GAPDH的含量。
actin即肌動蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論的。beta-actin作為內(nèi)參是得到了公認(rèn)的，這是針對大多數(shù)組織和細(xì)胞來說的，它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，表達(dá)量非常豐富。盡管*近有一些文章已經(jīng)開始質(zhì)疑beta-actin作為內(nèi)參的有效性（好像是對于上樣量>20ug的蛋白區(qū)分能力下降，記不清楚了），但是發(fā)文章應(yīng)該還是沒有問題的。至于其他的內(nèi)參也是可以考慮用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，而tubulin和actin類似，是細(xì)胞骨架的組成部分，但是不是肌肉的主要成分，應(yīng)該是一個代替品。
actin幾種異構(gòu)體存在組織分布特異性，不同型actin之間具有較高的序列相似性（>90%）。β-actin是分布于非肌細(xì)胞中的一種骨架蛋白，選擇作β-actin內(nèi)參時首先得保證是組織廣泛表達(dá)的（尤其是做蛋白的組織表達(dá)譜時）。那么制備β-actin抗體的抗原應(yīng)該是選用與actin其它異構(gòu)體一致的氨基酸序列。公司制備抗體是選用beta-actin的某一段小短肽作為免疫原，可能會因?yàn)檫x取的短肽在不同型actin之間保守與否,而導(dǎo)致所制備抗體具有一定的組織特異性.如選取的短肽僅在beta型存在,所得抗體就僅能檢測非肌細(xì)胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在,則此抗體除非肌細(xì)胞外,還可以檢測cardiac，skeletal，smooth muscle細(xì)胞的actin
Western Blot檢測系統(tǒng)中常用交聯(lián)酶兩大家族中的另外一類就是AP——堿性磷酸酶。做過AP實(shí)驗(yàn)的經(jīng)常會遇到膜上顯色背景偏高的問題，所以就WesternBlot本身來說偏愛HRP的要比AP多——分子克隆III解釋說由于在我們常用的封閉劑：脫脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，這樣當(dāng)然顯色背景會高。所以分子克隆III推薦的AP適用封閉劑是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65度加熱一小時確保AP失活后再用于封閉。一些研究的樣本自身也含有較高水平的堿性磷酸酶，雖然實(shí)驗(yàn)上很容易實(shí)現(xiàn)抑制內(nèi)源AP影響，但實(shí)際上容易被忽略。AP顯色底物生成的產(chǎn)物主要是藍(lán)紫色，成像性好容易拍照。如今由于HRP系的化學(xué)發(fā)光底物已經(jīng)不斷改進(jìn)而使得靈敏度不斷提高，化學(xué)發(fā)光顯色上HRP和AP不相上下，但是生色反應(yīng)來說，AP顯色的靈敏度還是比一般的HRP顯色底物要高。單抗專一性高，但是經(jīng)過SDS-PAGE變性膠電泳的蛋白質(zhì)可能由于原來的識別位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變而不被識別，多抗不如單抗專一性高但更容易得到結(jié)果。
附：在Western Blotting實(shí)驗(yàn)過程中使用內(nèi)參的方法有：
一、 超級簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。
二、普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。
三、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。

原創(chuàng)作者：上海信帆生物科技有限公司