機(jī)體免疫應(yīng)答過程的復(fù)雜性和嚴(yán)格的調(diào)控性，是由多種免疫細(xì)胞和免疫分子共同參與而完成的。而免疫應(yīng)答的核心是T淋巴細(xì)胞的活化。

       研究表明，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化、增殖及分化為效應(yīng)細(xì)胞需要雙信號刺激：信號來自抗原由TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)并由粘附分子增強(qiáng)；第二信號即協(xié)同刺激信號由APCs表面的協(xié)同刺激分子和T細(xì)胞的相應(yīng)受體相互作用后產(chǎn)生。協(xié)同刺激分子主要分為免疫球蛋白超家族、TNF／TNFR超家族及細(xì)胞因子超家族三種。B7／CD28屬于免疫球蛋白超家族，其提供的第二信號，是迄今為止公認(rèn)的*基本的協(xié)同刺激信號。B7家族分子屬于免疫球蛋白超家族，其成員主要有B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7-H1（PD-（?）1）、B7-DC（PD-L2）、B7-H2（GL50）和B7-H3等，主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞（APC）表面。

       但近年來的研究證實(shí)，部分B7家族分子還表達(dá)于關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)腔T細(xì)胞、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血T細(xì)胞、DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間后的T細(xì)胞表面。CD28分子為Mr．44KD的同源二聚體組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白。1980年首先由Hansen等用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)，隨后將人的CD28分子基因克隆并表達(dá)，主要表達(dá)于9596的CD4~+T細(xì)胞和50％的CD8~+T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、成熟胸腺細(xì)胞和部分NK細(xì)胞等。與其天然配體CD80／CD86分子結(jié)合形成的協(xié)同刺激信號，在免疫應(yīng)答的早期發(fā)揮重要作用。其在降低T細(xì)胞活化閾值、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和Th1／Th2分化、誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-XL表達(dá)、增加細(xì)胞因子IL-2的分泌、促進(jìn)免疫突觸形成及阻止T細(xì)胞失能等方面均具有重要作用。對該信號進(jìn)行選擇性調(diào)控，可促使機(jī)體對腫瘤的排斥和腫瘤細(xì)胞的殺傷，有助于自身免疫性疾病或超敏反應(yīng)及異體器官移植排斥的防治。另外，可溶性CD28分子在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮何種作用，在腫瘤、免疫缺陷病、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中又 鼠抗人CD28分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學(xué)的特性的鑒定 中文摘要 有何意義，目前仍不清楚。

    因此，CD28功能性單克隆抗體的研制及可溶性CD28分子 檢測方法的建立，為CD28及相關(guān)協(xié)同刺激分子的:基礎(chǔ)研究和腫瘤、移植排斥反應(yīng)、 自身免疫性疾病等臨床應(yīng)用研究提供重要手段。 1.CO28單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究 1 .1雜交瘤細(xì)胞的建株及亞類鑒定 以天然高表達(dá)CD28分子的人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266作為免疫原，經(jīng)絲裂霉 素（MMC）處理（50 pg/1 X10，細(xì)胞）后，免疫BALB/C小鼠，分頸部、皮下多點(diǎn)及腹 腔注射。采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫后的小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SPZ/0進(jìn)行融合。以小鼠惡性淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)人CD28基因細(xì)胞株CD28一T作為篩選細(xì)胞 株，同時(shí)以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的母本細(xì)胞及不表達(dá)CD28分子的OaUdi細(xì)胞作為陰性對照細(xì) 胞株，經(jīng)HAT培養(yǎng)、間接免疫熒光分析和多次的克隆化培養(yǎng)及反復(fù)篩選，在融合的 72塊96孔板中，*終獲得5株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CD28單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞株，分別命名為2D5、2F5、3B6、3F8和8G8。經(jīng)快速定性試紙分析法鑒定，5株 單抗中的2D5屬小鼠IgGZa亞類，其余均為工gGI，正類。經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，液氮 凍存半年以上，復(fù)蘇后仍生長良好，分泌抗體的憶有旨穩(wěn)定。 1.2單克隆抗體的制備、純化及效價(jià)測定 采用本室建立的體內(nèi)腹水誘生法制備單克隆抗體。將生長良好的雜交瘤細(xì)胞注入 經(jīng)Pri stane預(yù)致敏的BALB/C小鼠腹腔。5~10天后收獲腹水，離心后收集含有單抗 的上清。小鼠腹水陽性形成率為900k以上，腹水收獲量平均為7.4ml/只，個(gè)別小鼠達(dá) 25ml/只以上。經(jīng)ProteinG親和層析法純化抗休，抗體蛋白含量在1.2一4.7mg/m1 腹水之間。將腹水型單抗、雜交瘤培養(yǎng)上清和純化后mAb用PBS梯度稀釋后，與U266 細(xì)胞反應(yīng)，間接免疫熒光法分析，以出現(xiàn)同樣陽性率的稀釋倍數(shù)或*小蛋白濃度 為抗體的效價(jià)。結(jié)果表明，培養(yǎng)上清中單抗效價(jià)為l:200以上，腹水型單抗效價(jià)為l: 2000以上，純化的抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為0.5 pg/5 x IJ細(xì)胞。 1.3單抗識別的抗原位點(diǎn)及對不同細(xì)胞株膜型CO28分子的識別 采用競爭抑制結(jié)合試驗(yàn)，2D5和8G8能完全阻折陽性對照直標(biāo)單抗CD28一FITC與 U266細(xì)胞的結(jié)合，表明2D5和8G8與陽性對照單伉識別相同或相似的抗原位點(diǎn);其 鼠抗人CD28分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學(xué)的特性的鑒定中文摘要 余3株能部分阻斷對照單抗與U266的結(jié)合，提示該3株單抗與陽性對照單抗識別不 同或不完全相同的抗原位點(diǎn)。 將生長良好、高表達(dá)CD28分子的人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266和XGI、新鮮分離 的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）、T惡性淋巴瘤細(xì)胞株J盯kat和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞CD28一T分 別與抗體反應(yīng)，通過間接免疫熒光法和流式細(xì)胞儀（FCM）分析，結(jié)果顯示，5株單 抗均能良好地識別表達(dá)在不同細(xì)胞上的CD28分子， 1 .4單抗對pB丁C的激發(fā)效應(yīng)及活化T細(xì)胞的表型分析 采用CD28單抗聯(lián)合激發(fā)型CD3單抗激發(fā)PBT〔（通過Fic011密度梯度法和磁珠 陰性選擇去除CD19、CD56陽性細(xì)胞即B細(xì)胞和NK!扭胞后獲得）。鼠抗人CD3單抗（0、5 pg/ml）包被96孔板，100 pl/孔，吸去包被液，PBS洗滌2遍。

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