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點(diǎn)擊次數(shù)：16487 發(fā)布時(shí)間：2024/1/2 9:51:43
PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)的模板濃度
服務(wù)內(nèi)容：
1.制定個(gè)性化實(shí)驗(yàn)方案：根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定實(shí)驗(yàn)方案、選定合適的內(nèi)參；
2.檢測(cè)類別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；
3.樣本抽提及質(zhì)檢：對(duì)客戶提供樣本進(jìn)行RNA抽提，并利用NanoDrop進(jìn)行樣本質(zhì)檢；
4.定量PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)：包括樣本反轉(zhuǎn)錄為CDNA、配置PCR反應(yīng)體系及進(jìn)行Real-TimePCR反應(yīng)；
5.正式定量PCR實(shí)驗(yàn)：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)；
6.數(shù)據(jù)分析：采用2- △△CT法進(jìn)行分析，比較不同樣本間差異。
影響Ct值的關(guān)鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的*主要因素�？刂圃谝粋�(gè)合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間
反應(yīng)液成分的影響
任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響－－－－比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應(yīng)的效率
PCR反應(yīng)的效率也會(huì)影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會(huì)所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說(shuō)來(lái)，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。
Real-time qPCR常見(jiàn)參數(shù)
基線（baseline）通常是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)
同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線
閾值（threshold）
自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍
手動(dòng)設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)
同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。
Ct值:與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。
分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。
如何評(píng)估實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果
PCR擴(kuò)增效率：為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。
另一個(gè)評(píng)估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2，它是說(shuō)明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語(yǔ)。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過(guò)Y值來(lái)預(yù)測(cè)X值。R2值大于0.99 時(shí)，兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。
PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)的模板濃度
原創(chuàng)作者：上海信帆生物科技有限公司
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