明膠酶譜檢測試劑盒

明膠酶譜法是一種新型的蛋白質(zhì)分析方法，它可以提供準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)質(zhì)量分析和分子量分析結(jié)果。明膠酶譜法可以快速有效地測定蛋白質(zhì)中的氨基酸和糖基化激酶的活性。這種方法通

過使用蛋白質(zhì)，核酸和其他復(fù)合物構(gòu)成的聚合物，結(jié)合相關(guān)的酶誘發(fā)反應(yīng)，來分析蛋白質(zhì)的質(zhì)量和分子量。這些復(fù)合物可以在單獨(dú)的氨基酸片段中用來測量激酶反應(yīng)，從而識別活性位點(diǎn)，反映了蛋白質(zhì)質(zhì)量和分子量分析的結(jié)果。

明膠酶譜法的原理是基于膠質(zhì)酶結(jié)合物，它由多種蛋白質(zhì)，核酸和其他復(fù)合物組成，使用酶

誘發(fā)反應(yīng)來分析蛋白質(zhì)的質(zhì)量和分子量。該方法由激酶和聚合物組成，它們分別催化了激酶和聚合物的反應(yīng)，從而產(chǎn)生了激酶的活性。此外，該方法還能夠測量氨基酸片段的活性，這將有助于評估蛋白質(zhì)的質(zhì)量和分子量。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2、MMP-9 活性Zymography 是一種廣為使用的、基于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達(dá) 1nM，高于 ELISA 方法 2，其基本原理和程序是: 制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng) Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解舒膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透 亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩中液，可檢測少至0.10-0.5ul血液中的MMP-2、MMP-9 譜及活性，檢測靈敏度~1 nM。試劑盒可進(jìn)行 50 次標(biāo)準(zhǔn)小較檢測，如果小較加樣為 10-15個(gè)，則總計(jì)可檢測500-750 個(gè)樣品。

檢測目的:

本試劑盒用于檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 ａnd MMP9 as low as 1nM）

檢測步驟：

5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。、

5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液�？赏ㄟ^預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

注：因?yàn)槿�血成分�?fù)雜,MMP活性較低，的方法是將全血中白細(xì)胞進(jìn)行分離做陽性對照

5.3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

5.4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時(shí)。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時(shí)間為10小時(shí)或過夜。

5.6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

5.7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

試劑盒組成與儲存:

A. 2 x SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml, -20℃保存

B.10 x Substrate G, 50 ml,-20℃保存:

C.10 x Buffer A,50 ml,4℃保存,使用時(shí)用蒸餾水稀釋

D.10 x Buffer B,50 ml,4 ℃保存,使用時(shí)用蒸餾水稀釋:

E.SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液,50ml,4℃保存

注意事項(xiàng)

1.10 mM EDTA能夠抑制MMP活性

2.凝膠干燥:可使用聚丙烯-酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠，作為記錄保留。

3.本試劑盒僅供科研實(shí)驗(yàn)使用，不得用于食用、臨床醫(yī)療等其它用途。

4.實(shí)驗(yàn)操作中，請穿戴好實(shí)驗(yàn)服、防護(hù)口置和一次性實(shí)驗(yàn)手套，避免直接接觸，嚴(yán)禁入口。

使用該試劑盒發(fā)表的文章:
 

參考文獻(xiàn)：

1. Nagase H ａnd Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, ａnd Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate ａnd copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202

明膠酶譜檢測試劑盒

原創(chuàng)作者：上海信帆生物科技有限公司