植物組織在脅迫環(huán)境條件下會產(chǎn)生多種活性氧（ROS），ROS 活性非常大且極其不穩(wěn)定，因此 ROS 的檢測通常因其*終產(chǎn)物而定。超氧陰離子是活性氧的一種，屬于一種含氧自由基，能將 NBT（氮藍四唑）還原成不溶于水的藍色甲瓚化合物，從而定位組織中的超氧陰離子。

植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)根據(jù)上述基本原理也稱為 NBT 染色法，用于植物活組織中的超氧陰離子染色。一般應(yīng)用于較嫩的根尖、葉片等的整體染色，染色后有超氧陰離子聚集的部位呈藍色至深藍色。該產(chǎn)品僅用于科研領(lǐng)域，不用于臨床診斷或其他用途。

自備材料：

1、新鮮的植物葉片或根、自來水、蒸餾水、95%乙醇

2、超聲波、磁力攪拌器、電子天平、濾紙、照相機

操作步驟(僅供參考)：

1、試劑準(zhǔn)備：將 50 mg NBT 加入到 100mL 磷酸緩沖液(pH 7.4) 中充分溶解，即得 NBT染色工作液，2-8℃避光保存，一月內(nèi)有效。注：如果較難溶解，可通過超聲、磁力攪拌等方法促溶。

2、樣本準(zhǔn)備：采集經(jīng)脅迫（例如重金屬）的采集植物幼苗或根尖，自來水稍洗凈，置于濾紙上吸干多余水分。

3、染色：將植物幼苗或根尖浸入 NBT 染色工作液中，常溫避光浸染 2~6 h，至陽性部位出現(xiàn)深藍色，其余部位為淡藍色或近無色或呈植物本身的顏色即可。（根據(jù)植物幼嫩程度。顯色程度調(diào)整染色時間）

4、脫色：用鑷子將植物幼苗或者葉片小心取出，浸入蒸餾水中來回漂洗 3~5 次，置于濾紙上吸干多余水分后，浸入 95%乙醇中 40℃處理 3~16 h，目的是脫去植株幼苗或者葉片本身的葉綠素或者淡藍色背景，處理期間可多次更換新鮮的 95%乙醇。

5、觀察：用鑷子取出植株幼苗或者葉片，浸入蒸餾水中來回漂洗 3~5 次，置于濾紙上吸干多余水分后，將樣本轉(zhuǎn)入適量 NBT 樣本保存液中浸泡 30 min 后，隨后可取出拍照。樣本可置于該溶液中常溫保存一周。

注意事項：

1、NBT 染色工作液配制好以后需 2-8℃避光保存，一月內(nèi)使用。存放時間過久，會影響顯色。

2、因任何外在因素都可能刺激植物應(yīng)激產(chǎn)生超氧陰離子，因此植物樣本需要新鮮采集，并盡快完成染色。建議做陰性及陽性空白對照組。

3、樣本染色完成后盡快拍照保存結(jié)果。

4、染色和脫色步驟也可參考如下建議操作：組織放入染液中，抽真空，-0.1MPa 保持負(fù)壓20~30min，再于室溫下靜置染色 60min，棄染色液；加入 95%乙醇，于 70~80℃水浴鍋脫色，每隔 10min 換一次 95%乙醇，待樣品綠色全部褪去后可停止脫色。

5、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)操作步驟

原創(chuàng)作者：上海信帆生物科技有限公司

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植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)操作步驟

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