本產(chǎn)品僅供科研實驗，不得用于醫(yī)療或食用。

 重組蛋白表達純化服務

原核蛋白表達系統(tǒng)是迄今為止為成熟可靠的蛋白表達系統(tǒng)，能快速表達純化各種不同來源蛋白。大量制備的重組蛋白可用于藥物篩選、結構生物學研究、細胞生物學研究、蛋白質(zhì)組學研究等的一系列生物醫(yī)學領域的研究。

特點：

• 本公司可以通過原核蛋白小量表達測試的工藝放大，在中試級別的體系中獲得重組蛋白。
• 可以根據(jù)客戶的需要提供各種表達標簽，包括His、GST、MBP、NusA、 TrxA、 Sumo、 AviTag™等。
• 本公司可以通過離子交換、透析超濾、凝膠過濾、親和層析等方法對目的蛋白進行精細的分離純化。
• 本公司可提供靈活的標簽系統(tǒng)的純化方案，甚至復合標簽的純化方案。
• 可獲得純度90%以上的重組蛋白，本公司的CoolCut技術還可以獲得無標簽的重組蛋白。
• 實驗結果經(jīng)過SDS–PAGE凝膠電泳檢測。交付時間: 4–6周。

• 具有20多種表達用菌株，可獲得高產(chǎn)的工程菌。
• 擁有表達克隆構建、多功能標簽的選擇，密碼子優(yōu)化等相關技術服務；可有效地解決高產(chǎn)工程菌基因工程問題。

注意：

• 本公司在本項服務中提供的重組蛋白不保證活性。
• 本公司在本項服務中的收費需要協(xié)商，可按蛋白毫克數(shù)和純度定價；也可按過柱次數(shù)定價。

重組蛋白用途：

• 抗原蛋白
• 蛋白標準品
• 蛋白活性研究

服務內(nèi)容

1. 大腸桿菌（E. coli）表達系統(tǒng)

2. 畢赤酵母（P. pastoris）表達系統(tǒng)

3. 桿狀病毒（Baculovirus）表達系統(tǒng)

4. 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

價格與信息

一：大腸桿菌（E. coli）表達系統(tǒng)

步驟

1. 目標基因全基因合成：

1.從基因庫中搜索目標蛋白的cDNA序列。

2.根據(jù)選用的表達系統(tǒng)對cDNA進行密碼子，mRNA二級結構等的優(yōu)化。

3.合成設計好的基因序列。

交付內(nèi)容：目的基因（在T載體或常規(guī)穿梭載體上）及測序報告。

時間：2周

步驟2. 目標基因亞克隆：

1.擴增并抽提含有目標基因的載體質(zhì)粒。

2.將目標基因亞克隆到合適的表達質(zhì)粒上。

3.測序驗證構建質(zhì)粒的準確性。

4.可提供表達載體（PET系列為主）

交付內(nèi)容：正確構建的重組表達質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測序報告。

時間：2-3周

步驟3. E. coli 表達菌株轉化及篩選：

1.擴增并抽提構建好的表達質(zhì)粒。

2.將表達質(zhì)粒轉化到高效的E. coli表達菌株中。

3.至少挑選5個陽性克隆于LB培養(yǎng)基中擴增并選擇合適的條件，SDS-PAGE 檢測蛋白表達情況，篩? 選出合適菌株。

4.可提供表達菌株：DH5α, Top10, JM115, BL21 （DE3）, BL21 （DE3） pLys, XL1 Blue等。

交付內(nèi)容：重組質(zhì)粒的表達菌株及表達檢測報告。

時間：2-3周

步驟4. 目標蛋白表達及純化：

1.對時間，溫度以及IPTG濃度等表達條件進行優(yōu)化，誘導表達目標蛋白。

2.搖瓶培養(yǎng)1L重組細菌，通過親和，離子交換，疏水及凝膠過濾等層析方法純化表達的重組蛋白。

3.利用蛋白酶去除不需要的純化標簽（Tag），再純化獲得所需的目標蛋白（可選，構建表達載體需加入合適的蛋白酶切位點）。

4.通過SDS-PAGE電泳檢測每步結果并控制終產(chǎn)品質(zhì)量。

5.通過Western-blot驗證目標蛋白正確性

交付內(nèi)容：純化好的目標蛋白5~10mg及純化報告。可按客戶要求提供含純化標簽（Tag）或切除純化標簽（Tag）的終蛋白，純度高可達95%以上。

時間：2-3周

說明：

1. 如果沒有獲得目標蛋白，則不收取任何費用。如果終得到的產(chǎn)品未達到合同要求而客戶又同意接受該產(chǎn)品，則雙方協(xié)商本步驟費用。

2. 如果客戶需要詳細的純化工藝，包括詳細純化條件及每步結果，則需要加收100%相應費用。

3. 因為每個重組蛋白的表達量及純化得率都不相同，我們終根據(jù)實際情況將給客戶提供少5mg，多10mg的目標蛋白，所收取的費用是相同的。

4. 我們提供的終產(chǎn)品一般為保存于常規(guī)的緩沖液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸鈉緩沖液）中蛋白質(zhì)溶液，并且其中不含有尿素或鹽酸胍等變性劑。但因為我們無法為每個定制的蛋白建立活性檢測系統(tǒng)，所以我們無法保證終產(chǎn)品的生物學活性，不過我們承諾將會按照大可能保護其活性的方法來制備目標蛋白。如果客戶一定要求目標蛋白活性，我們可以先提供約50μg純化后樣品供客戶檢測活性。若樣品活性不合格，我們不再提供目標蛋白給客戶并只收取本步驟費用的30% ，而如果樣品活性合格，我們將提供合同要求的相同質(zhì)量的目標蛋白給客戶并需要加收本步驟費用的100%。

5. 每次Western-blot檢測多7個樣品，因為要加入陽性對照，陰性對照以及Marker。本步驟只包含一次免費檢測，如果需要更多次檢測則需另收費。我們可以免費為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測結果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測結果（可能會出現(xiàn)假陽性或是假陰性的結果）。如果結果不正常，我們可以免費重做一次。

步驟5. 目標蛋白的再加工及詳細檢測：

1.對生物學活性要求較高的純化后蛋白產(chǎn)品進行復性研究。

2.內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進一步加工。

3.通過HPLC，質(zhì)譜等方法詳細檢測目標蛋白的質(zhì)量

服務內(nèi)容：

1復性研究：利用多達20種不同復性緩沖液的體系，對目標蛋白進行小量復性試驗提供復性后樣品供客戶檢測，可

根據(jù)客戶要求，按照其中一種樣品的復性條件制備小量的復性蛋白，可提供具體的復性緩沖液配方及復性工藝。

2：除內(nèi)毒素，

3：過濾除菌，

4：凍干，5：HPLC檢測，

6：質(zhì)譜檢測，

7：N端測序。

交付內(nèi)容：加工后的終產(chǎn)品及相關實驗和檢測報告。

時間：2-3周

步驟6. 大規(guī)模制備：

按照小試工藝放大生產(chǎn)規(guī)模，制備客戶需要的合格蛋白產(chǎn)品。

交付內(nèi)容：合格的目標蛋白及服務報告。

時間：協(xié)商

二：畢赤酵母（P. pastoris）表達系統(tǒng)

步驟1. 目標基因全基因合成：

1.從基因庫中搜索目標蛋白的cDNA序列。

2.根據(jù)選用的表達系統(tǒng)對cDNA進行密碼子，mRNA二級結構等的優(yōu)化。

3.合成設計好的基因序列。

交付內(nèi)容：目的基因（在T載體或常規(guī)穿梭載體上）及測序報告。

時間：2-3周

步驟2. 目標基因亞克�。�

1.擴增并抽提含有目標基因的載體質(zhì)粒。

2.將目標基因亞克隆到合適的表達質(zhì)粒上。

3.測序驗證構建質(zhì)粒的準確性。

4.可提供表達載體：pPICZα和pPIC9K和pGAPCZα。

交付內(nèi)容：正確構建的重組表達質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測序報告。

時間：2-3周

步驟3. P. pastoris表達菌株電轉化：

1.酶切線性化表達質(zhì)粒。

2.將表達質(zhì)粒通過電轉化到高效的P.pastoris表達菌株中。

3.通過PCR鑒定至少挑選5個陽性克隆。

4.可提供表達菌株：X33，GS115，KM71和SMD1168。

交付內(nèi)容：PCR陽性克隆及PCR結果報告

時間：2周

步驟4. P. pastoris 表達菌株篩選：

1.將5個陽性克隆于BMGY培養(yǎng)基中擴增，然后換至BMMY培養(yǎng)基中，并加入甲醇誘導表達目標蛋白。

2.SDS-PAGE電泳檢測培養(yǎng)上清中目標蛋白的表達情況，并挑選合適的單克隆菌株用于目標蛋白的表達

3.如果培養(yǎng)上清中檢測不到表達，則通過將上清濃縮20倍作用再檢測，或通過Western-blot方法檢測目標蛋白表達（客戶需要提供相關抗體）。

交付內(nèi)容：陽性克隆菌株及表達篩選結果報告。

時間：2周

步驟5. P. pastoris表達菌株表達優(yōu)化：

1.挑選20個陽性克隆進行常規(guī)表達篩選，并對其中表達好菌株優(yōu)化表達條件。

2.對挑選出來的單克隆菌株，優(yōu)化培養(yǎng)及誘導條件（培養(yǎng)基，菌體密度，甲醇濃度，誘導時間等），提高目標蛋白的表達量。

交付內(nèi)容：三個陽性克隆菌株及優(yōu)化表達條件結果報告。。

時間：2周

步驟6. 目標蛋白表達及純化：

1.搖瓶培養(yǎng)1L重組酵母菌，誘導表達目標蛋白。

2.通過親和，離子交換，疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達的重組蛋白。

3.通過SDS-PAGE電泳檢測每步結果并控制終產(chǎn)品質(zhì)量。

4.通過Western-blot驗證目標蛋白正確性。

交付內(nèi)容：純化好的目標蛋白1~10mg及純化報告�？砂纯蛻粢�求提供含純化標簽（Tag）或切除純化標簽（Tag）的終蛋白，純度高可達90%以上。

時間：2-3周

說明：

1. 如果沒有獲得目標蛋白，則不收取任何費用。如果終得到的產(chǎn)品未達到合同要求而客戶又同意接受該產(chǎn)品，則雙方協(xié)商本步驟費用。

2. 如果客戶需要詳細的純化工藝，包括詳細純化條件及每步結果，則需要加收100%相應費用。

3. 因為每個重組蛋白的表達量及純化得率都不相同，我們終根據(jù)實際情況將給客戶提供少1mg，多10mg的目標蛋白，所收取的費用是相同的。

4. 我們提供的終產(chǎn)品一般為保存于常規(guī)的緩沖液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸鈉緩沖液）中蛋白質(zhì)溶液，并且其中不含有尿素或鹽酸胍等變性劑。但因為我們無法為每個定制的蛋白建立活性檢測系統(tǒng)，所以我們無法保證終產(chǎn)品的生物學活性，不過我們承諾將會按照大可能保護其活性的方法來制備目標蛋白。如果客戶一定要求目標蛋白活性，我們可以先提供約50μg純化后樣品供客戶檢測活性。若樣品活性不合格，我們不再提供目標蛋白給客戶并只收取本步驟費用的30% ，而如果樣品活性合格，我們將提供合同要求的相同質(zhì)量的目標蛋白給客戶并需要加收本步驟費用的100%。

5. 每次Western-blot檢測多7個樣品，因為要加入陽性對照，陰性對照以及Marker。本步驟只包含一次免費檢測，如果需要更多次檢測則需另收費。我們可以免費為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測結果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測結果（可能會出現(xiàn)假陽性或是假陰性的結果）。如果結果不正常，我們可以免費重做一次。

步驟7. 目標蛋白的再加工及詳細檢測：

1.內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進一步加工。

2.通過HPLC，質(zhì)譜等方法詳細檢測目標蛋白的質(zhì)量。

服務內(nèi)容：

1：除內(nèi)毒素，

2：過濾除菌，

3：凍干，.

4：HPLC檢測，

5：質(zhì)譜檢測，

6：N端測序。

交付內(nèi)容：加工后的終產(chǎn)品及相關實驗和檢測報告。

時間：2周

步驟8. 大規(guī)模制備：

按照小試工藝放大生產(chǎn)規(guī)模，制備客戶需要的合格蛋白產(chǎn)品。

交付內(nèi)容：合格的目標蛋白及服務報告。

時間：協(xié)商

三：桿狀病毒（Baculovirus）表達系統(tǒng)

步驟1. 目標基因全基因合成：

1.從基因庫中搜索目標蛋白的cDNA序列。

2.根據(jù)選用的表達系統(tǒng)對cDNA進行密碼子，mRNA二級結構等的優(yōu)化。

3.合成設計好的基因序列。

交付內(nèi)容：目的基因（在T載體或常規(guī)穿梭載體上）及測序報告。

時間：2-3周

步驟2. 目標基因亞克隆到pFastBac供體質(zhì)粒：

1.擴增并抽提含有目標基因的載體質(zhì)粒。

2.將目標基因亞克隆到pFastBac供體載體上。

3.測序驗證構建質(zhì)粒的準確性。

4.通過中抽獲得重組的質(zhì)粒DNA

交付內(nèi)容：正確構建的重組表達質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測序報告。

時間：2-3周

步驟3. 制備重組桿狀病毒Bacmid DNA：

1.將重組的pFastBac供體質(zhì)粒轉化到大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)菌株中。

2.通過抗生素平板篩選出含有重組Bacmid的菌株。

3.抽提質(zhì)粒獲得重組的桿狀病毒Bacmid DNA。

交付內(nèi)容：重組桿狀病毒Bacmid DNA，含重組質(zhì)粒的DH10Bac菌株

時間：2周

步驟4. 轉染昆蟲細胞Sf-9：

1.利用轉染試劑將重組Bacmid質(zhì)粒轉入昆蟲細胞Sf-9。

2.收集成熟的重組桿狀病毒并檢測病毒的滴度。

3.通過多次感染提高病毒的滴度，并擴增病毒數(shù)量。

4.通過SDS-PAGE和Western-blot檢測目標蛋白表達情況。

交付內(nèi)容：高滴度重組桿狀病毒，病毒滴度及蛋白表達檢測結果（如果轉染不成功，則不收取費用。如果沒有檢測到目標蛋白表達，則只收取50%實驗費用）。

時間：3周

步驟5. 目標蛋白表達及純化：

1.培養(yǎng)500ml昆蟲細胞至對數(shù)期，然后加入適量病毒感染細胞并表達目標蛋白。

2.收集含有目標蛋白的部分（細胞或培養(yǎng)上清）。

3.通過親和，離子交換，疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達的重組蛋白。

4.通過SDS-PAGE電泳檢測每步結果并控制終產(chǎn)品質(zhì)量。

5.通過Western-blot驗證目標蛋白正確性。

6.可提供表達細胞株：Sf-9，Sf-9 Mimic，High Five。

交付內(nèi)容：純化好的目標蛋白0.1~2mg及純化報告�？砂纯蛻粢�求提供含純化標簽（Tag）或切除純化標簽（Tag）的終蛋白，純度高可達90%以上。

時間：2-3周

說明：

1. 如果沒有獲得目標蛋白，則不收取任何費用。如果終得到的產(chǎn)品未達到合同要求而客戶又同意接受該產(chǎn)品，則雙方協(xié)商本步驟費用。

2. 如果客戶需要詳細的純化工藝，包括詳細純化條件及每步結果，則需要加收100%相應費用。

3. 因為每個重組蛋白的表達量及純化得率都不相同，我們終根據(jù)實際情況將給客戶提供少0.1mg，多2mg的目標蛋白，所收取的費用是相同的。

4. 我們提供的終產(chǎn)品一般為保存于常規(guī)的緩沖液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸鈉緩沖液）中蛋白質(zhì)溶液，并且其中不含有尿素或鹽酸胍等變性劑。但因為我們無法為每個定制的蛋白建立活性檢測系統(tǒng)，所以我們無法保證終產(chǎn)品的生物學活性，不過我們承諾將會按照大可能保護其活性的方法來制備目標蛋白。如果客戶一定要求目標蛋白活性，我們可以先提供約50μg純化后樣品供客戶檢測活性。若樣品活性不合格，我們不再提供目標蛋白給客戶并只收取本步驟費用的30% ，而如果樣品活性合格，我們將提供合同要求的相同質(zhì)量的目標蛋白給客戶并需要加收本步驟費用的100%。

5. 每次Western-blot檢測多7個樣品，因為要加入陽性對照，陰性對照以及Marker。本步驟只包含一次免費檢測，如果需要更多次檢測則需另收費。我們可以免費為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測結果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測結果（可能會出現(xiàn)假陽性或是假陰性的結果）。如果結果不正常，我們可以免費重做一次。

步驟6. 目標蛋白的再加工及詳細檢測：

1內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進一步加工。

2通過HPLC，質(zhì)譜等方法詳細檢測目標蛋白的質(zhì)量。

服務內(nèi)容：

1：除內(nèi)毒素，

2：過濾除菌，

3：凍干，

4：HPLC檢測，

5：質(zhì)譜檢測，

6：N端測序。

交付內(nèi)容：加工后的終產(chǎn)品及相關實驗和檢測報告。

時間：2-3周

步驟7. 大規(guī)模制備：

按照小試工藝放大生產(chǎn)規(guī)模，制備客戶需要的合格蛋白產(chǎn)品。

交付內(nèi)容：合格的目標蛋白及服務報告。

時間：協(xié)商

四：哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

步驟1. 目標基因全基因合成：

1.從基因庫中搜索目標蛋白的cDNA序列。

2.根據(jù)選用的表達系統(tǒng)對cDNA進行密碼子，mRNA二級結構等的優(yōu)化。

3.合成設計好的基因序列。

交付內(nèi)容：目的基因（在T載體或常規(guī)穿梭載體上）及測序報告。

時間：2-3周

步驟2.：目標基因亞克隆到哺乳動物細胞表達載體

1.擴增并抽提含有目標基因的載體質(zhì)粒。

2.將目標基因亞克隆到真核表達載體上。

3.測序驗證構建質(zhì)粒的準確性。

4.通過中抽獲得重組的質(zhì)粒DNA

交付內(nèi)容：正確構建的重組表達質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測序報告。

時間：2周

步驟3. 小量轉染并通過Western-blot檢測表達：

1.利用轉染試劑將重組質(zhì)粒轉入合適的哺乳動物細胞中。

2.從轉染后24到72小時，每12小時取樣，通過SDS-PAGE和Western-blot檢測目標蛋白表達情況。

3.可提供表達細胞株：293，293T，NIH/3T3，COS-7，CHO。

交付內(nèi)容：目標蛋白表達結果。

時間：2周

說明：

1. 如果轉染不成功，則不收取費用。如果沒有檢測到目標蛋白表達，也要收取80%實驗費用。

2.每次Western-blot檢測多7個樣品，因為要加入陽性對照，陰性對照以及Marker。我們可以免費為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測結果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測結果（可能會出現(xiàn)假陽性或? 是假陰性的結果）。如果結果不正常，我們可以免費重做一次。

步驟4. 目標蛋白表達及純化：

1.培養(yǎng)500ml哺乳動物細胞，然后將重組質(zhì)粒轉染到細胞中，通過瞬時表達產(chǎn)生目標蛋白。

2.收集含有目標蛋白的部分（細胞或培養(yǎng)上清）。

3.通過親和，離子交換，疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達的重組蛋白。

4.通過SDS-PAGE電泳檢測每步結果并控制終產(chǎn)品質(zhì)量。

5.通過Western-blot驗證目標蛋白正確性。

交付內(nèi)容：純化好的目標蛋白及純化報告�？砂纯蛻粢�求提供含純化標簽（Tag）或切除純化標簽（Tag）的終蛋白，純度高可達90%以上。

時間：3-4周

說明：

1. 如果沒有獲得目標蛋白，則不收取任何費用。如果終得到的產(chǎn)品未達到合同要求而客戶又同意接受該產(chǎn)品，則雙方協(xié)商本步驟費用。

2. 如果客戶需要詳細的純化工藝，包括詳細純化條件及每步結果，則需要加收100%相應費用

3. 因為每個重組蛋白的表達量及純化得率都不相同，我們終根據(jù)實際情況將給客戶提供少0.1mg，多2mg的目標蛋白，所收取的費用是相同的。

4. 我們提供的終產(chǎn)品一般為保存于常規(guī)的緩沖液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸鈉緩沖液）中蛋白質(zhì)溶液，并且其中不含有尿素或鹽酸胍等變性劑。但因為我們無法為每個定制的蛋白建立活性檢測系統(tǒng)，所以我們無法保證終產(chǎn)品的生物學活性，不過我們承諾將會按照大可能保護其活性的方法來制備目標蛋白。如果客戶一定要求目標蛋白活性，我們可以先提供約50μg純化后樣品供客戶檢測活性。若樣品活性不合格，我們不再提供目標蛋白給客戶并只收取本步驟費用的30% ，而如果樣品活性合格，我們將提供合同要求的相同質(zhì)量的目標蛋白給客戶并需要加收本步驟費用的100%。

5. 每次Western-blot檢測多7個樣品，因為要加入陽性對照，陰性對照以及Marker。本步驟只包含一次免費檢測，如果需要更多次檢測則需另收費。我們可以免費為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測結果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測結果（可能會出現(xiàn)假陽性或是假陰性的結果）。如果結果不正常，我們可以免費重做一次。

步驟5. 目標蛋白的再加工及詳細檢測：

1.內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進一步加工。

2.通過HPLC，質(zhì)譜等方法詳細檢測目標蛋白的質(zhì)量。通過親和，離子交換，疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達的重組蛋白。

服務內(nèi)容：

1：除內(nèi)毒素，

2：過濾除菌，

3：凍干，

4：HPLC檢測，

5：質(zhì)譜檢測，

6：N端測序。

交付內(nèi)容：加工后的終產(chǎn)品及相關實驗和檢測報告。

時間：2周

步驟6. 篩選穩(wěn)定高表達細胞株：

1.將轉染后的哺乳動物細胞團轉到96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，然后加入含有MTX的培養(yǎng)基。

2.當細胞長到大約2/3孔時，取培養(yǎng)上清檢測表達。

3.挑出高表達的細胞團用于下一輪篩選，并在下一次細胞培養(yǎng)基中提高MTX的濃度。

4.重復加壓篩選過程，提高細胞株的表達量直到獲得合適的穩(wěn)定表達株。

5.通過SDS-PAGE電泳檢測每步表達結果。

6.通過Western-blot驗證目標蛋白正確性。

交付內(nèi)容：穩(wěn)定的高表達細胞株及篩選報告。

時間：6-8周

說明：因為每個重組蛋白的表達量受多種條件影響，我們并不能保證終穩(wěn)定株的表達量，但一般只有瞬時表達時表達量的1/10左右。

步驟7. 大規(guī)模制備：

按照小試工藝放大生產(chǎn)規(guī)模，制備客戶需要的合格蛋白產(chǎn)品。

交付內(nèi)容：合格的目標蛋白及服務報告。

時間：協(xié)商

更新時間：2024/11/26 14:28:51