產(chǎn)品名稱：	輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒
產(chǎn)品編號：	XFAY1-1
檢測方法：	高效液相色譜法
產(chǎn)品規(guī)格：	50管/48樣
運(yùn)輸：	快遞送貨上門
應(yīng)用范圍：	科研用檢測試劑
輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒
輔酶ⅠNAD（H）含量測定試劑盒說明書（50T）
一、測定意義：
NAD 是糖酵解和 TCA 循環(huán)的主要?dú)涫荏w，生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈傳遞把電子交
給氧，在合成 ATP 的同時(shí)，形成大量的 ROS，同時(shí) NADH 再生為 NAD。糖、脂、蛋白質(zhì)
三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD（H）含量和 NADH/NAD
比值的高低可用于評價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD（H）及 NADH/NAD 比值說
明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)，NADH/NAD 比值升高也可抑制糖酵解和 TCA
循環(huán)。另外，NAD 降解產(chǎn)物具有非常重要的調(diào)控作用。
二、測定原理：
NAD 和 NADH 在 254 nm 下有吸收峰，利用高效液相色譜法在相應(yīng)波長下測定其含量。
三、試驗(yàn)中需自備的儀器和試劑：
高效液相色譜儀、低速離心機(jī)、溶劑抽濾裝置、針頭式過濾器（水系，50 個(gè)，0.22μm）、
濾膜（水系和有機(jī)系各 2 個(gè)，0.45μm）、C18柱（4.6 ×150 mm）、可調(diào)式移液器、樣品瓶（50
個(gè)，2mL）、乙腈（120 mL）、甲醇（色譜級，300 mL）、蒸餾水
注：若用自動進(jìn)樣器，需要樣品瓶，測定時(shí)將不少于 1mL 的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入樣品瓶
中。無自動進(jìn)樣器，需手動進(jìn)樣時(shí)，不需要樣品瓶，用進(jìn)樣針將不少于 20ul 的樣品或標(biāo)準(zhǔn)
品打入進(jìn)樣閥。

輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒

四、試劑的組成和配制：
試劑一：粉劑 1×1 瓶，粉劑 2×1 瓶，4℃保存；臨用前用少量蒸餾水將粉劑 1 和粉劑 2 溶解
后倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至 100mL，形成 NAD 和 NADH 提取液（注：試
劑瓶中的粉劑要沖洗干凈），4℃保存 3 個(gè)月；
試劑二：粉劑 1×1 瓶，粉劑 2×1 瓶，粉劑 3×1 瓶，4℃保存；臨用前用少量蒸餾水將粉劑
1、粉劑 2 和粉劑 3 溶解后倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至 1000mL，形成流動相緩
沖液基質(zhì)（注：試劑瓶中的粉劑要沖洗干凈）, 4℃保存 3 個(gè)月。
試劑三：NAD 標(biāo)準(zhǔn)品 5mg×1 支，-20℃保存。加入 1mL 試劑一，配成 5mg/mL 溶液，現(xiàn)配
現(xiàn)用，用不完的試劑-20℃保存。
試劑四：NADH 標(biāo)準(zhǔn)品 5 mg×1 支，-20℃保存。加入 1mL 試劑一，配成 5mg/mL 溶液，現(xiàn)
配現(xiàn)用，用不完的試劑-20℃保存。五、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：
1. 將雙蒸水 1000 mL、流動相緩沖液基質(zhì) 1000 mL、甲醇 300 mL 和乙腈 120 mL 用
0.45 μm 的濾膜抽濾，以除去溶劑中的雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱。（注：雙蒸水和緩
沖液基質(zhì)用水系濾膜抽濾，乙腈用有機(jī)系濾膜抽濾）。
2. 流動相的配制：將抽濾完畢的流動相緩沖液基質(zhì) 1000 mL 與乙腈配比為 9：1（v/v），
即取 900mL 緩沖液基質(zhì)與 100 mL 乙腈混合。[每個(gè)樣品需要約 12mL 流動相，流
動相用量（mL）=12mL×樣品數(shù)量+跑基線用量（約 50mL），流動相的用量請根
據(jù)樣品數(shù)量用多少配多少]。
3. 將抽濾完畢的甲醇和雙蒸水配比成 100%的甲醇， 10%的甲醇，雙蒸水各 250 mL。
4. 將 2 和 3 中的溶劑超聲 30 分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱。
六、輔酶ⅠNAD（H）的提�。�
組織的處理：準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比（g/mL）加 9 倍試劑一，提取 NAD 和
NADH，制成 10%勻漿。20000 g/min 離心 30 min，取上清液用 0.22μm 水系針頭式過濾器過
濾后待測，同時(shí)測定組織蛋白含量。
細(xì)胞處理：收集于 60 mL 細(xì)胞，離心菌體經(jīng)高壓冷凍干燥 12 h 后，加入 2 mL 試劑一。
超聲破壁細(xì)胞（950 W，30%，15 min，工作 1 s，間隔 2 s），再經(jīng) 10,000r 4℃高速離心 40 s，
上清用 0.22μm 水系微孔濾膜過濾后直接上柱檢測。

輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒

七、輔酶ⅠNAD（H）含量測定操作步驟：
1. 開啟電腦、檢測器和泵，安裝上色譜柱，打開 empower 軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣
量 20 μL，流速 0.8 mL/min，保留時(shí)間 15min，檢測波長 254nm,設(shè)置完畢保存方法
組。
2. 用 100%的甲醇、10%的甲醇、雙蒸水按甲醇濃度從大到小的順序洗色譜柱 30min。
3. 用流動相洗柱子，待基線穩(wěn)定后開始加樣。
4. 加入標(biāo)準(zhǔn)品 20 μL，在 15min 內(nèi)可分離 NAD 和 NADH， NAD 的保留時(shí)間在 3min
左右，NADH 的保留時(shí)間在 7min 左右（柱子不同，保留時(shí)間有差異），計(jì)算不同濃
度的 NAD 和 NADH 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。
5. 加入樣品 20 μL，在相應(yīng)保留時(shí)間處檢測 NAD 和 NADH 的峰面積。八、輔酶ⅠNAD（H）含量的計(jì)算：
1. NAD 含量的計(jì)算
NAD 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
將 5mg/ml 的 NAD 標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水分別稀釋成 110 μg/ml、80 μg/ml、50 μg /ml、和 20 μg
/ml 的 NAD 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算不同標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積。
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為: y = 25069χ- 26754（χ 為 NAD 濃度，μ g/ml；y 為峰面積）
推出：χ=（y + 26754）÷25069（χ 為 NAD 濃度，μ g/ml；y 為峰面積）
NAD 含量（μg/mg prot）=（樣品峰面積+26754）÷25069÷Cprot
Cprot 為待測樣本蛋白濃度
2. NADH含量的計(jì)算
NADH 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
將 5mg/ml 的 NADH 標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水分別稀釋成 200 μg/ml、150 μg/ml、100 μg/ml 和
50 μg/ml 的 NADH 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算不同標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積。
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為: y = 13275χ+35717（χ 為 NADH 濃度，μ g/ml；y 為峰面積）
推出：χ=（y – 35717）÷13275（χ 為 NADH 濃度，μ g/ml；y 為峰面積）
NADH 含量（μg/mg prot）=（樣品峰面積 - 35717）÷13275÷Cprot
Cprot 為待測樣本蛋白濃度
注：標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)要根據(jù)樣品中 NAD 和 NADH 濃度確定，樣品中 NAD 和 NADH 的
峰面積必須落在不同濃度的 NAD 和 NADH 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之內(nèi)，該標(biāo)準(zhǔn)曲線緊供參考。

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更新時(shí)間：2024/11/26 14:30:40

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