· 上 傳 者： 上海信帆生物科技有限公司

· 上傳時(shí)間：2015/5/26 15:53:02

· 文件大�。�51KB

· 文件類型：doc

· 所屬分類：其它資料

· 下載次數(shù)：47次

· 查看次數(shù)：1327

· 資料簡(jiǎn)介： 細(xì)胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

本所細(xì)胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)多肽底物受到CAMKII磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)，即采用光度法測(cè)定其氧化后吸光峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中CAMKII活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或完全純化酶樣品中CAMKII激酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases；CAMK；EC2.7.11.17）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員，主要由Ca2+/鈣調(diào)素復(fù)合物調(diào)控，在細(xì)胞分裂和分化、神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)分泌、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、糖原代謝、肌肉收縮、記憶、心功能等方面發(fā)揮作用。在大多數(shù)組織中表達(dá)，尤其在神經(jīng)組織中高度表達(dá)。功能分類為特異型，其代表為肌凝蛋白輕鏈蛋白激酶（myosin light chain kinase；MLCK）和多功能型，其代表為Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II；CAMKII）。亞型分類為I型、II型、和IV型。亞體分類為α、β、γ、δ四種。Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端催化域（catalytic）、中央調(diào)節(jié)域（regulatory，包含自發(fā)抑制域——autoinhibitory domain；AID和Ca2+/鈣調(diào)素結(jié)合中心），和C端協(xié)同域（association），Ca2+/鈣調(diào)素復(fù)合物激活CAMK后，產(chǎn)生自發(fā)性自我磷酸化。Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬時(shí)變化，誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（potentiation）、突觸可塑性（synaptic plasticity）、神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)合成和釋放、與記憶和學(xué)習(xí)功能相關(guān)。其磷酸化目標(biāo)序列為KKALRRQETVDAL。基于底物KKALRRQETVDAL，在ATP的存在下，受到Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

本所清理液（Reagent A）  毫升

本所裂解液（Reagent B）  毫升

本所緩沖液（Reagent C） 毫升

本所酶促液（Reagent D） 微升

本所反應(yīng)液（Reagent E） 微升

本所底物液（Reagent F）  微升

本所陰性液（Reagent G） 微升

產(chǎn)品說(shuō)明書   1份

保存方式

保存本所清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

CAMKII激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品預(yù)處理

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 107細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升本所清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升本所清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升本所裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用本所 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

3． 本所緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升本所緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升本所陰性液（Reagent G）

3． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置10分鐘

4． 加入xx微升本所酶促液（Reagent D）

5． 加入xx微升本所反應(yīng)液（Reagent E）

6． 加入xx微升本所底物液（Reagent F）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升本所緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入5微升待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）

3． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置10分鐘

4． 加入xx微升本所酶促液（Reagent D）

5． 加入xx微升本所反應(yīng)液（Reagent E）

6． 加入xx微升本所底物液（Reagent F）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升本所緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加入xx微升本所陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

4． 在30℃溫度下孵育10分鐘

5． 分別加入xx微升本所酶促液（Reagent D）

6． 分別加入xx微升本所反應(yīng)液（Reagent E）

7． 分別加入xx微升本所底物液（Reagent F）

8． 輕輕搖動(dòng)96孔板

9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

10． 活性計(jì)算：

七、抑制劑篩選

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、完全活性和待測(cè)抑制劑樣品

2． 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

3． 分別加入xx微升本所酶促液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升本所反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升本所底物液（Reagent F） 

6． 輕輕搖動(dòng)96孔板

7． 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀30分鐘

8． 抑制活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液 

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測(cè)定

7． 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘

8． 光度測(cè)定后，比色皿須清洗徹底

9． 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 本所 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1） 

11． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

12． 可以使用CAMKII抑制劑（KN-93；IC50=370納摩爾）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

13． Ca2+/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

14． 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

使用承諾

公司秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說(shuō)明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。