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· 上 傳 者： 上海信帆生物科技有限公司
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· 資料簡介： 小鼠腫瘤壞死因子α （TNF-α ）試劑盒使用說明書 本試劑盒僅供研究使用。 檢測范圍：96T 詳見說明書 使用目的： 本試劑盒用于測定小鼠細胞培養(yǎng)液樣本中腫瘤壞死因子α （TNF-α ）含量。 實驗原理 本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠腫瘤壞死因子α （TNF-α ）水平。用純化 的小鼠腫瘤壞死因子α （TNF-α ）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中 依次加入腫瘤壞死因子α （TNF-α ），再與 HRP 標記的腫瘤壞死因子α （TNF-α ）抗體結 合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶 的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死 因子α （TNF-α ）呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲 線計算樣品中腫瘤壞死因子α （TNF-α ）濃度。 試劑盒組成 1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 7 終止液 6ml×1 瓶 2 酶標試劑 6ml×1 瓶 8 標準品（1600 ng/L） 0.5ml×1 瓶 3 酶標包被板 12 孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶 4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書 1 份 5 顯色劑 A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 張 6 顯色劑 B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 個 標本要求 1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能 馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融 2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟 1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀 釋。 800 ng/L 5 號標準品 150μl 的原倍標準品加入 150μl 標準品稀釋液 400 ng/L 4 號標準品 150μl 的 5 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液 200 ng/L 3 號標準品 150μl 的 4 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液 100 ng/L 2 號標準品 150μl 的 3 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液 50 ng/L 1 號標準品 150μl 的 2 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液 2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、 待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl， 然后再加待測樣品 10μl（樣品*終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。 3.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。 4.配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用 5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復 5 次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。 7.溫育：操作同 3。 8.洗滌：操作同 5。 9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 10 分鐘. 10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。 計算 以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標 準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)， 即為樣品的實際濃度。 注意事項 1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未 用完，板條應裝入密封袋中保存。 2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。 3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間 控制在 5 分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值 大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計 算時請*后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物請避光保存。 7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準. 8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 9．本試劑不同批號組分不得混用。 保存條件及有效期 1．試劑盒保存：2-8℃ 2．有效期：6 個月
11. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止 液后 15 分鐘以內進行。
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